EvaGreen多重實時熒光定量PCR同時檢測多種豬病毒研究.pdf

1、豬細小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcinecircovirus2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabiesv

2、irus，PRV)這幾種病毒引起的疾病在臨床上常呈現(xiàn)出相似的呼吸和繁殖障礙癥狀，并且常常呈混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。依據(jù)常規(guī)病原學檢測及臨床病理變化很難作出準確的判斷，尤其是多種病原混合感染時，難以進行早期快速檢測，容易產生誤判錯判，因此建立一種快速準確能同時對多種病原進行檢測的方法對疾病的診斷和防治具有重要意義，而兼有多重PCR和實時熒光PCR優(yōu)點的多重實時熒光PCR方法可以應用于多病原混合感染的快速檢測。
　　多重實時熒

3、光PCR包括熒光探針和熒光染料兩類。探針多重實時熒光PCR的特異性較好，但由于受到實時熒光PCR儀器檢測通道限制，無法同時進行四種以上的病原檢測，而且設計多條探針會增加總成本。熒光染料多重實時熒光PCR是通過識別擴增產物熔解峰以達到檢測目的，不受檢測通道限制。熒光染料EvaGreen相比SYBRGreenⅠ具有更高敏感性和穩(wěn)定性，而且在多重檢測中克服了對擴增子的結合偏愛性，因此EvaGreen更適合于多重實時熒光PCR，基于本研究建立的

4、EvaGreen多重實時熒光PCR方法，能夠快速有效的同時檢測六種豬病毒，并具有簡便易行、成本較低等優(yōu)點。
　　基于最終需要建立EvaGreen多重實時熒光PCR方法，本研究首先建立了六種豬病毒EvaGreen單重實時熒光PCR檢測方法，其中六種病毒經實時熒光PCR擴增后產生的熔解峰能夠有效區(qū)分，是各病毒單重實時熒光PCR優(yōu)化的前提條件，通過選定的引物同時對目的核酸序列和非目的核酸序列擴增來檢測特異性，結果顯示PCV2、PPV、P

5、RRSV、CSFV、JEV和PRV均無非特異性擴增;并進行六種病毒的靈敏度檢測，其中PCV2和CSFV的檢測極限可達10copies/μl,PRV和JEV的檢測極限可達25copies/μl，PPV和PRRSV的檢測極限可達50copies/μl;分別選取各病毒的3個濃度進行批內和批間重復試驗，變異系數(shù)均在5％以內，顯示各病毒單重實時熒光PCR重復性良好。在六種豬病毒EvaGreen單重實時熒光PCR優(yōu)化完成的基礎上，建立一個EvaGr

6、een多重實時熒光PCR體系，經實時擴增能夠產生六個目的擴增產物的熔解峰，其中PCV2擴增產物的熔解峰相應的熔解溫度(Tm)為77.7±0.29℃，PPV為79.5±0.36℃，PRRSV為82.2±0.30℃，CSFV為85.3±0.35℃，JEV為87.3±0.31℃及PRV為91.3±0.25℃，從而可同時對這六種病毒進行檢測。通過分別加入靶基因和非靶基因進行擴增，以檢測特異性，結果顯示六種豬病毒在EvaGreen多重實時熒光PC

7、R中均無非特異性擴增;并進行了靈敏度檢測，靈敏度結果顯示:PCV2、PRRSV和JEV的檢測極限達到100copies/μl;PPV、CSFV檢測極限可以達到250copies/μl;PRV的檢測極限可以達到500copies/μl;同時進行了批內和批間重復試驗，結果顯示批內和批間重復的Tm變異系數(shù)均在5％以內。由于多病原混合感染也常出現(xiàn)在實際檢測中，故選取幾種較易發(fā)生混合感染的病毒組合進行靈敏度檢測，其中在CSFV濃度為106copi

8、es/μl時，PCV2靈敏度可達250copies/μl;PCV2濃度為105copies/μl時，PRRSV靈敏度可達250copies/μl;PPV濃度為106copies/μl時，PCV2靈敏度可達500copies/μl;PCV2、PPV濃度分別為105copies/μl和106copies/μl時，PRRSV的最低檢測極限為500copies/μl。本研究表明，六種豬病毒的多重EvaGreen實時熒光PCR方法具有較好的特異性

9、、靈敏度、重復性。
　　應用建立的EvaGreen多重熒光PCR方法對58份血清和60份組織樣品分別進行了檢測。58份血清樣品中，PCV2的陽性率為19.0％，PRRSV的陽性率為24.1％，PCV2與PRRSV混合感染占總樣品數(shù)10.3％;在對60份組織樣品檢測中，PCV2、PPV、PRRSV和PRV檢出率分別為23.3％、15％、16.7％及5％，PCV2與PRRSV、PCV2與PPV及PCV2、PPV與PRRSV混合感染檢出