豬瘟病毒實時熒光定量PCR快速檢測試劑盒的研制與應用.pdf

1、為了在我國建立特異、敏感、快速的CSFV診斷技術，為CSF的凈化和控制提供有力的技術手段。本研究將熒光定量PCR(FQ一PCR)技術與ABI定量檢測系統(tǒng)相結合，根據(jù)GenBank下載的29條豬瘟病毒(CSFV)全長序列、18條牛病毒性腹瀉病病毒一I(BVDV-I)和6條BVDV-II全序列進行綜合比對，為保證CSFV熒光探針的特異性，避開與BVDV同源部分，設計了5組CSFV的特異性探針和引物；采用SM、HCLV細胞毒和GDZl／95、

2、HeBHHl／95、BJCYl／96、JLl／94陽性CSF血毒樣品篩選了最佳探針和引物，優(yōu)化了反轉錄酶用量、上下游引物濃度和探針濃度等反應試劑，建立了FQ-PCR檢測CSFV的試驗體系；通過體外轉錄制備了介于5'-UTR與NPrO之間的非感染性RNA標準品，經核酸蛋白紫外分析儀測定RNA純度較高(0D260／0D280一1．9345)，建立的CT值與模板起始濃度對數(shù)之間的線性關系良好，相關系數(shù)為r=0．999，斜率為一3．412，并將

3、系列稀釋的CSFVRNA標準品經重復測定證實批內和批間重復性均較好，變異系數(shù)分別為O．66-4．42％和0．77-4．19％；在其它病原體的特異性試驗中，其它病原的檢出率均為零，說明該方法具有很強的CSFV特異性；在敏感度符合試驗方面，與CSF免疫熒光試驗(HCFA)符合率為88％，且比HCFA方法更敏感，較RT-nPCR方法敏感100倍；分別采用分三次合成、經相應檢驗合格的引物和探針及其他試劑按優(yōu)化后反應體系的要求配制成三批CSFVF

4、Q-PCR試劑，編號為20051001、20051002、20051003，進行可重復性試驗和為期lO個月的穩(wěn)定性試驗，綜合評價了CSFVFQ-PCR檢測方法的多項指標，并進行了試劑盒組裝，成功研制了特異、靈敏、快速的CSFVFQ-PCR實驗室診斷試劑盒。本試劑盒與進口試劑Ready-To-GoRT-PCRBeads和常規(guī)RT-nPCR相比，從反應時間、CT值表現(xiàn)、熒光增幅和試驗成本等多方面都體現(xiàn)了FQ-PCR檢測CSFV的優(yōu)越性。

5、 采用研制的CSFVFQ一PCR試劑盒與HCFA或病毒分離檢測方法對我國19個省市自治區(qū)的61個采樣點187份可疑CSF組織病料進行臨床應用符合試驗，統(tǒng)計結果顯示CSFVFQ一PCR技術對所有組織病料的陽性檢出率為50．80％，HCFA的陽性率為41．27％，差異極顯著(t：3．643，p<0．01)，且FQ一PCR與HCFA間的符合率為86．24％。將CSFVFQ-PCR檢出為陽性，同時HCFA為陰性的樣品，采用RT-nPCRE2

6、基因全長擴增產物測序驗證，證實了實時CSFVFQ一PCR試劑盒對于田間樣品CSF病原的診斷具有快速、準確和敏感的特性。 為了對HCLV生產進行全程量化質量監(jiān)控，將CSFVFQ-PCR技術應用于HCLV疫苗細胞培養(yǎng)液半成品的效力檢驗，分別對3個批次，總共13次收的疫苗原液和5、10、15、20、25萬倍稀釋液，同時用兔體定型熱反應和FQ-PCR進行檢測，比較并確立兩種實驗結果問的相關性，即兩只兔子均為定型熱反應的CT值范圍為26．