基于LAMP和熒光定量PCR技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型和豬細(xì)小病毒檢測試劑盒的研制.pdf

1、上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征fPostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)是由豬圓環(huán)病毒2型(PorcineCircovirusType2，PCV2)引起的一種重要疾病，嚴(yán)重發(fā)病地區(qū)死亡率高達(dá)40％以上，殘存下來的病豬也極少康復(fù)。由于PCV2嚴(yán)重破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致各種疫苗接種應(yīng)答效果差，免疫失敗，并且誘發(fā)其他疾病暴發(fā)。因此，PCV2感染的早期診斷和病豬的淘汰成

2、為PMWS防治的重點。有必要開發(fā)出一種豬PCV2的定性、定量快速檢測方法用于PMWS的防控。豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PorcineParvovirus，PPV)弓I起的以初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等為特征的豬的主要繁殖障礙性疾病之一，此外，PPV能增強豬圓環(huán)病毒引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。PPV分布廣泛，通過水源、食物、交配、胎盤等途徑感染豬，并能在外界環(huán)境長時間存活且對大部分消毒劑不敏感，難于防治，

3、給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害。所以非常有必要建立一種快速、特異并適合在基層推廣的檢測方法。本實驗旨在建立PCV2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)和熒光定量PCR檢測方法以及PPV環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)檢測方法，研制PCV2和PPV的LAMP現(xiàn)場可視化快速定性檢測試劑盒和PCV2熒光定量PCR定量檢測試劑盒

4、，并對反應(yīng)體系和參數(shù)進行優(yōu)化以及對制備工藝進行研究。主要內(nèi)容及結(jié)果如下：l、豬細(xì)小病毒(PPV)LAMP可視化快速檢測方法建立及試劑盒的研制本研究旨在建立有效的針對豬細(xì)小病毒(PPV)的診斷技術(shù)及開發(fā)試劑盒。建立一種快速、敏感、特異的檢測豬細(xì)小病毒(PPV)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法，為診斷豬細(xì)小病毒提供準(zhǔn)確可靠工具。根據(jù)GenBank公布的PPV序列，利用PrimerExplorerV3在其保守序列區(qū)域設(shè)計了LAMP引物，通過對

5、引物比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、PCR各組分等條件的優(yōu)化，建立了對PPV病毒DNA進行特異擴增的LAMP檢測方法，研制LAMP檢測試劑盒，并對試劑盒敏感性、特異性、重復(fù)性和保存期等指標(biāo)進行評價。該方法在60。C恒溫下作用50min，上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要異性引物和探釧‘，通過體系優(yōu)化，以重組質(zhì)粒建立10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR擴增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了對PCV2病毒DNA進行特異擴增的熒光定量PCR檢測方法，研制熒光

6、定量PCR檢測試劑盒，并對試劑盒敏感性、特異性、重復(fù)性和保存期等性能進行評價。該檢測試劑盒循環(huán)閾值(Ct)與標(biāo)準(zhǔn)DNA模板在lOI_107拷貝缸L濃度范圍內(nèi)具有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為09999。本實驗重復(fù)性好，批內(nèi)實驗中Ct值的變異系數(shù)在059％到105％之間，批間實驗的Ct值變異系數(shù)為19％N42％。本實驗研制的檢測試劑盒與豬瘟病毒(CSFV)、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)不發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測