豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及培養(yǎng)工藝的初步探討.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)有2種基因型，分別為PCV1和PCV2，其中PCV1不致病，可以長(zhǎng)期感染PK-15細(xì)胞，早期被認(rèn)為是一種細(xì)胞污染物。而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的主要病原，還可導(dǎo)致豬繁殖障礙（reproductive failure）、豬皮炎與腎病綜合癥(porcine dermatiti

2、s and nephropathy syndrome，PDNS)和呼吸道疾病綜合癥(Porcine respiratory disease syndrome，PRDS)等疾病，這些疾病通常被稱為與PCV2相關(guān)性疾病(PCVAD)。自發(fā)現(xiàn)PMWS疾病后，PCV2帶來(lái)的疾病已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在建立熒光定量PCR及間接免疫熒光這兩種檢測(cè)方法檢測(cè)PCV2。主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 (1)重組質(zhì)粒pM

3、D-ORF2的構(gòu)建根據(jù)GenBank中豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在引物上游引入BanHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。用PCR擴(kuò)增出PCV2 DNA中ORF2片段（全長(zhǎng)為702bp），然后將此基因片段連接到pMD20-T載體，經(jīng)PCR、酶切鑒定后，篩選出重組質(zhì)粒pMD-ORF2。
　　 (2) PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立根據(jù)PCV2ORF2基因序列中的保守片段設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物及

4、TaqMan探針。以重組質(zhì)粒pMD-ORF2為模板，通過(guò)條件優(yōu)化，以定量的10倍稀釋梯度的質(zhì)粒pMD-ORF2為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立PCV2的熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL，比普通PCR的靈敏度高出100倍，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和靈敏度。
　　 PK-15細(xì)胞是PCV2體外增殖的常用宿主細(xì)胞，PCV2雖然可以在體內(nèi)長(zhǎng)期以高滴度存在，但在體外培養(yǎng)中其增殖滴度反而較低

5、且不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)為提高PCV2在體外培養(yǎng)滴度，從收毒時(shí)間、是否添加D-氨基葡萄糖、培養(yǎng)的穩(wěn)定性及培養(yǎng)系統(tǒng)四個(gè)方面進(jìn)行初步探討，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接毒的細(xì)胞可以不需要D-氨基葡萄糖處理;接毒后72h收獲的PCV2病毒拷貝數(shù)明顯高于24h及48h收獲的病毒拷貝數(shù);因?yàn)镻CV2的毒價(jià)和穩(wěn)定性不夠，所以選擇在細(xì)胞上連續(xù)傳代，直至第四代后，病毒的拷貝數(shù)才趨于穩(wěn)定并隨之增加，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)PCV2有很強(qiáng)的宿主依賴性;在小方瓶、轉(zhuǎn)瓶及微載體三種培養(yǎng)