豬嵴病毒全基因組序列分析及熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、豬嵴病毒(Porcine kobuvirus, PKoV)屬微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),嵴病毒屬(Kobuvirus),為單股正鏈RNA病毒。雖然PKoV與豬群中臨床癥狀的關(guān)系尚不確定,但是由于陽性率較高,可能與其他病毒一起發(fā)生混合感染而導(dǎo)致疾病。目前國內(nèi)外針對豬嵴病毒的研究甚少,因此有必要對其進行相關(guān)基礎(chǔ)研究。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、鸥鶕?jù)GenBank上發(fā)表的PKoV全基因組序列,在3D保守區(qū)設(shè)計特異

2、性引物,對上海周邊地區(qū)采集的116份豬糞樣品進行PCR檢測。結(jié)果顯示PKoV陽性率為38.8％(45/116)。在三個豬場(分別位于青浦區(qū)、閔行區(qū)和奉賢區(qū))中,陽性率分別為46.7%(21/45)、35.1%(13/37)和32.4%(11/34),結(jié)果證實PKoV在上海周邊地區(qū)豬群中廣泛存在。利用SPSS13.0軟件對實驗統(tǒng)計結(jié)果進行分析,結(jié)果表明仔豬可能比育肥豬更容易感染PKoV,并且可能與腹瀉有關(guān)。利用MEGA4.0軟件進行系統(tǒng)進

3、化分析,結(jié)果表明在上海地區(qū)PKoV存在基因多樣性。
　?、聘鶕?jù)已知的PKoV全基因組序列設(shè)計10對引物,進行全基因組序列擴增并進行序列分析。結(jié)果顯示:病毒的基因組長度為8210nt,僅含有一個由7467個核苷酸組成的開放閱讀框(open reading frames, ORF),編碼一個多聚蛋白為2488 aa。通過與參考毒株基因組序列Y-1-CH(GU292559)和S-1-HUN(EU787450)的比較,發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)比非結(jié)

4、構(gòu)蛋白區(qū)具有更多的基因突變。應(yīng)用Simplot軟件對PKoV進行全基因組序列的基因重組分析,結(jié)果表明該毒株可能發(fā)生了早期的部分基因重組,可能是PKoV基因多樣性的一個重要基礎(chǔ)。
　?、歉鶕?jù)PKoV的全基因組序列設(shè)計引物,通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法,并與常規(guī)RT-PCR檢測方法進行了比較。結(jié)果顯示,在模板濃度7.02×101~7.02×109拷貝/μL范圍內(nèi)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,熒光閾值(C