犬博卡病毒GZHD15株全基因序列分析及PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、博卡病毒是一種可感染多種動物的小DNA病毒。近年來的研究逐步增多，主要是針對人博卡病毒（HBoV）、豬博卡病毒（PBoV）、牛博卡病毒（BPV）的檢測方法、基因分型、細胞培養(yǎng)技術、致病性等方面的研究。但基因型復雜、檢測方法滯后、致病機制報道很少，嚴重限制博卡病毒流行調(diào)查、防控技術儲備，尤其是犬博卡病毒(CBoVs)的研究相對較少。因此，本課題對實驗室保存的犬博卡病毒株GZHD15進行全基因序列分析，并建立PCR檢測方法。初步掌握了CBo

2、Vs在國內(nèi)地區(qū)性的流行情況，對提高檢測水平及CBoVs更深層次的研究提供基礎的科學數(shù)據(jù)資料和思路，具有科學價值和意義。
　　本課題選擇實驗室保存的犬博卡病毒株GZHD15，對其進行分段擴增全基因組，再全基因組克隆，對測序結果進行拼接，獲得一條全長5116bp的基因序列，將其與NCBI中的所有完整的CBoVs基因序列和其它博卡病毒部分完整基因序列構建進化樹，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GZHD15株與CBoV2的親緣關系最近，在CBoV2中，GZHD

3、15株與香港株（登錄號：JQ692588-JQ692590）和韓國株（登錄號：KP281717）親緣關系最近。運用NCBI中的在線軟件對其進行開放閱讀框（Open reading frame, ORF）預測，GZHD15株同其它CBOVs一樣，共3個ORF，分別編碼非結構蛋白NS1、NP1，結構蛋白VPI、VP2。在與NCBI中25條完整CBoVs基因全長比對中，GZHD15株與15株CBoV2的核苷酸同源性在92.6％-96.8%，與

4、MVC同源性普遍低于61.2%，與CBoV3同源性55.7%。與26條CBoVs基因序列的病毒蛋白NS1、NP1、VP1、VP2進行核苷酸和氨基酸同源性對比，結果和整體基因序列的比對結果保持一致。
　　參考CBoVs結構蛋白VP2的基因序列，用引物設計軟件Primer premier5.0設計一對檢測引物，建立PCR檢測方法，分別從退火溫度、引物用量兩方面對檢測方法進行優(yōu)化，并通過特異性實驗、敏感性實驗、重復性實驗驗證優(yōu)化后的檢測