犬巴貝斯蟲套式PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、巴貝斯蟲是一類蜱傳性寄生于紅細胞內(nèi)的血液原蟲，能對各種家畜和人造成嚴重危害。臨床上表現(xiàn)出貧血、發(fā)熱、黃疸、血紅蛋白尿等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)建立了多種用于檢測巴貝斯蟲的方法，然而各種方法各有利弊，需要更敏感、快速、簡單的診斷方法。為此，本研究建立了套式PCR檢測方法，并利用該方法對豫西地區(qū)寵物犬只血液樣品的血液原蟲進行鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。
　?、湃陌拓愃瓜x套式PCR檢測方法的建立。本研究根據(jù)GenBank中收錄的犬的巴貝

2、斯蟲18S rRNA基因序列，設(shè)計合成三組6對特異性診斷引物，利用實驗室中原有陽性標準品選出最優(yōu)組引物并建立套式PCR診斷方法。
　?、评锰资絇CR方法，對豫西地區(qū)(洛陽、平頂山、三門峽)各個縣市共20個動物醫(yī)院，15個大中型犬場(大于等于30只)的寵物犬進行調(diào)查，共采集犬血樣2960份，捕捉媒介蜱蟲813只。采用常規(guī)染色法、常規(guī)PCR法、套式PCR法進行檢測，并計算犬的巴貝斯蟲感染率。運用SZM系列體視顯微鏡進行形態(tài)學(xué)進行蜱蟲

3、觀察，以鑒定傳播犬巴貝斯蟲病的媒介中蜱蟲的種類。
　?、菍㈦S機抽取的25份陽性樣品送至華大基因科技服務(wù)有限公司進行測序，測序結(jié)果先用NCBI中的BLAST進行核酸同源性比較，用DNA Star5.0軟件聯(lián)合BioEdit軟件進行系統(tǒng)分析構(gòu)建進化樹。
　　結(jié)果顯示：最優(yōu)一組引物 PCR為上游: GGCTTTCGGTGATTCATA,下游:CCTTCCGTCAATTCCTTT, nPCR上游: TGGACCATTCAAGTTTC

4、TG，下游:TCGTCTTCGATCCCCTA，用該組引物建立了套式 PCR檢測方法，擴增出外引物片段為858 bp，內(nèi)引物片段為658 bp。該方法具有良好的特異性，用該方法不能擴增出附紅細胞體，巴氏桿菌 DNA等陰性樣品；同時該方法具有較高多的靈敏度，最低能擴增出含10拷貝的陽性樣品；本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豫西地區(qū)寵物犬中犬的巴貝斯蟲感染率為3.89％；隨機抽取的25株致病株均為吉氏巴貝斯蟲，致病株基因序列與美洲的18S rRNA(JX1

5、12784)同源性達100%，與亞洲株18S rRNA(KF878944/KF171474/AB478328/AB478330)同源性為98.8%；而在豫西地區(qū)犬的巴貝斯蟲媒介以鐮形扇頭蜱為主(52.4%)，蜱蟲帶蟲率為2.33%。
　　結(jié)論：
　　⑴本實驗成功建立了犬巴貝斯蟲套式PCR檢測方法，可以用于犬巴貝斯蟲病的快速檢測和小范圍的流行病學(xué)調(diào)查；
　　⑵本研究發(fā)現(xiàn)豫西地區(qū)寵物犬的巴貝斯蟲感染率較低，目前發(fā)現(xiàn)的病原株