檢測(cè)新型鴨源鵝細(xì)小病毒的半套式PCR方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus,GPV）屬于細(xì)小病毒科成員之一，能夠引起雛鵝和雛番鴨發(fā)病，并以小腸粘膜表層壞死脫落能形成小腸栓塞為主要特征。自2015年以來(lái)，國(guó)內(nèi)不斷有報(bào)道稱櫻桃谷鴨、北京鴨爆發(fā)了一種以短喙長(zhǎng)舌為特征性癥狀的疾病（Duck Beak Atrophy and Dyndrome Syndrome,BADS）。經(jīng)Chen等人的分離鑒定，確定為新的鴨源鵝細(xì)小病毒（Novel Goose Parvovirus,NGP

2、V），本研究的目的是建立檢測(cè)新型鴨源鵝細(xì)小病毒（NGPV）的半套式PCR方法，用該方法對(duì)山東、江蘇兩地進(jìn)行了NGPV的流行情況調(diào)查的，并對(duì)分離的其中2株NGPV進(jìn)行全基因組測(cè)序及同源性和進(jìn)化樹(shù)的分析。
　　1.山東、江蘇兩地送檢病料的初步檢測(cè)
　　根據(jù)GeneBank已公布的GPV數(shù)據(jù)，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件設(shè)計(jì)了GPV的PCR檢測(cè)引物。對(duì)山東、江蘇兩地8個(gè)發(fā)病鴨群120只發(fā)病鴨分別提取心、肝、脾

3、、肺、腎、胸腺、法氏囊、胰腺、腦、膽汁10個(gè)臟器組織DNA，共計(jì)1200個(gè)樣進(jìn)行初步的PCR檢測(cè)，對(duì)引物的特異性進(jìn)行分析，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)鴨群及各個(gè)內(nèi)臟的檢出率。結(jié)果顯示用該方法檢測(cè)，每個(gè)群的最高檢出率為86.7％，最低檢出率為66.7%，平均檢出率為75.8%,除了腦沒(méi)檢出病毒核酸外，其他臟器中病毒核酸檢出率最高為肝臟（62.6%），最低為肺臟（9.9%），平均檢出率為34.5%。
　　2.檢測(cè)新型鴨源鵝細(xì)小病毒半套式PCR方法的建立

4、與應(yīng)用
　　根據(jù)GeneBank已公布的12株GPV、2株 NGPV的序列比對(duì)結(jié)果，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件在檢測(cè)設(shè)計(jì)引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了檢測(cè)NGPV的半套式PCR外側(cè)引物。GPV-A-F和GPV-A-R能擴(kuò)增出NGPV長(zhǎng)度為779bp的目的基因,同時(shí)NGPV-B-R與GPV-A-F組合能夠擴(kuò)出NGPV長(zhǎng)度為148bp的目的基因，而擴(kuò)不出小鵝瘟疫苗的目的基因。最佳條件探索結(jié)果：當(dāng)退火溫度為58℃，Mg2+濃

5、度為1.5mM（1.5μL），模板加1μL，引物各加1μL（1pM），31個(gè)循環(huán)時(shí)，效率最高。用建立的半套式PCR方法對(duì)病料檢測(cè)，特異性很好，對(duì)1型鴨圓環(huán)（DuCV-1）、2型鴨圓環(huán)病毒（DuCV-2）、鴨瘟病毒(DVE)、大腸桿菌（E.coli）、沙門氏菌（SE）、鴨疫里默氏桿菌（Ra）5種常見(jiàn)鴨病顯示陰性，靈敏性好，最低可以檢出100拷貝NGPV病毒核酸。
　　應(yīng)用建立的半套式PCR方法對(duì)前面普通PCR檢測(cè)的樣品進(jìn)行復(fù)檢，統(tǒng)計(jì)

6、每個(gè)鴨群和10個(gè)內(nèi)臟共計(jì)1200個(gè)樣的檢出率，并與普通PCR方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用建立的半套式PCR檢測(cè)，對(duì)鵝細(xì)小檢測(cè)陽(yáng)性的病料進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)鴨群的最高檢出率為93.3%，最低為73.3%，平均為80.8%,除了腦沒(méi)檢出病毒外，其他臟器的檢出率最高為肝臟（93.8%），最低檢出率為肺臟（23.7%），平均檢出率為55.8%，與普通PCR相比明顯提高了檢出率。流行情況調(diào)查表明，山東、江蘇2個(gè)地方的NGPV感染情況比較嚴(yán)重，

7、應(yīng)該引起重視。
　　3.SD-01株和SD-02株NGPV的全基因組測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析
　　根據(jù)GeneBank已公布的12株GPV和2株NGPV序列，用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件設(shè)計(jì)了5對(duì)擴(kuò)增NGPV的全基因組序列的引物，對(duì)分離的NGPV SD-01和SD-02毒株進(jìn)行分段擴(kuò)增并測(cè)序，拼接后獲得2株NGPV的全基因組序列，并與其他GPV和NGPV全基因組序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。SD-01和SD

8、-02的全基因組與其他的12株GPV同源性在92.2～97.0%，而與sdlc01和QH15的同源性99.1～99.6%之間，與MDPV-FM的同源性分別為80.9%和81.1%,進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)2株NGPV屬于GPV這一大分支，與 sdlc01株和QH15株在同一個(gè)小的分支上；對(duì)SD-01和SD-02的VP3基因與12株GPV的同源性分析，發(fā)現(xiàn)VP3與GDaGPV的同源性最低為93.0%，與82-032v最高為98.3%，SD-01與

9、sdlc01株和QH15株同源性均為99.8%，而與FM株的同源性僅為81.5%；對(duì)SD-01和SD-02的VP3編碼的氨基酸同源性分析，與FM株的同源性最低分別為91.0%和90.8%，與GDaGPV同源性最低分別為96.6%和96.4%，SD-01與B株、VG321株的同源性最高，均為98.7%，SD-01與NGPV的sdlc01株和QH15株相比同源性分別為100%和99.6%，SD-02和sdlc01和QH15相比分別為99.8