鵝細(xì)小病毒傳代致弱毒株的培育及膠體金免疫層析檢測方法的建立.pdf

1、鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的，該病是一種主要侵害4～20日齡雛鵝和雛番鴨的急性或亞急性敗血癥，具有高度傳染性，以發(fā)生滲出性腸炎為主要特征。該病傳播快，病死率高，5日齡以內(nèi)雛鵝感染，死亡率高達(dá)95％以上。鵝細(xì)小病毒病的傳播和流行對我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。
　　本研究從小鵝瘟疑似病例中分離到一病原，經(jīng)過PCR鑒定、IFA鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，確定該病原

2、為GPV并將其命名為GPV YG株。通過將GPV YG株在鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)和鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)上進(jìn)行交替?zhèn)鞔囵B(yǎng)，當(dāng)病毒在GEF上傳至第12代時(shí)，開始出現(xiàn)細(xì)胞病變;IFA檢測發(fā)現(xiàn)，隨著病毒感染時(shí)間的延長，感染細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)先增加隨后減少的變化趨勢，感染后第96 h陽性細(xì)胞數(shù)量最多;病毒的滴度隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸升高，當(dāng)病毒在GEF上傳至第50代時(shí)，GPV YG株細(xì)胞適應(yīng)毒毒價(jià)為106.5 TCID50/mL。雛鵝致病性試

3、驗(yàn)結(jié)果顯示，第50代病毒毒力明顯減弱，表現(xiàn)為感染雛鵝死亡和發(fā)病率降低，且死亡雛鵝無鵝細(xì)小病毒病的特征性病變及臨床表現(xiàn)。對接種了第50代病毒的雛鵝糞便進(jìn)行PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，接種后的第3天至第21天，雛鵝所排糞便內(nèi)均能檢測到GPV抗原，這表明GPV傳代致弱毒株能夠在雛鵝體內(nèi)持續(xù)增殖，并向外界環(huán)境排毒。易感雛鵝在接種GPV傳代致弱毒株后，體內(nèi)開始產(chǎn)生中和抗體，并且抗體滴度隨著時(shí)間的增長而逐漸升高，在接種后第4周，中和抗體滴度可達(dá)10-2.55

4、/0.2mL，之后抗體滴度有所下降。對F0代和F50代病毒的全基因組序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與F0代相比，F(xiàn)50代病毒共有89個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，主要位于VP基因;以及19個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，其中5個(gè)位于NS蛋白，14個(gè)位于VP蛋白。在F50代基因組5'端和3'端非編碼區(qū)，分別有一段堿基的插入，大小都為9nt。
　　此外，為建立一種快速、簡便、靈敏的GPV膠體金免疫層析檢測方法，本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，將其

5、標(biāo)記于純化的抗GPV VP3蛋白的單克隆抗體(mAb)2D5，在硝酸纖維素膜上噴涂純化的抗GPV VP3蛋白mAb4A8和羊抗鼠IgG抗體，分別作為檢測線和質(zhì)控線，制成檢測GPV的膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果表明，所制備的GPV檢測試紙條的最低檢測限度為104.15TCID50/mL;用制備的試紙條檢測GPV為陽性，而檢測其他主要水禽病病原均為陰性;同一批次和不同批次的試紙條對GPV陽性樣品的檢測結(jié)果均無差異;使用試紙條對已知的80份糞便