鵝細(xì)小病毒NS基因PCR和單抗競爭ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鵝細(xì)小病毒病(Goose parvovirus infection)又稱小鵝瘟(Gosling plague,GP)或Derzsy's病,主要侵害4日齡至20日齡雛鵝和雛番鴨,可以引起急性腸炎及肝、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器敗血性病變,尤其以小腸部位的纖維性、栓塞性病變?yōu)橹饕卣?。由于該病病程短、傳播快、死亡率?造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。由于該病每年均有不同程度的流行,長期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展,所以需要一

2、種準(zhǔn)確、簡便的診斷方法來對該病作出準(zhǔn)確診斷。
　　 本研究根據(jù)GenBank中鵝細(xì)小病毒(GPV)的7株全基因序列,在保守的NS區(qū)域設(shè)計(jì)了一對引物,以GPV-98E株鵝胚尿囊液的核酸提取物為模板,經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了檢測GPV的特異性PCR方法。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法對GPV核酸的最小檢出量為4.194pg,尿囊液的最小檢出量為0.15個(gè)ELD50:特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,采用該方法檢測GPV能夠擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的476b

3、p的特異性片段,而對作為對照的鴨腸炎病毒(DEV)、禽流感病毒(AIV)、鵝副粘病毒(GPMV)的核酸均未擴(kuò)增出任何條帶。并將其應(yīng)用于臨床檢測,對52份臨床感染的雛鵝的心、肝、腸等組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增,能夠檢測到相應(yīng)的特異性病毒核酸片段,表明建立的鵝細(xì)小病毒PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 本研究用超離純化的鵝細(xì)小病毒98E株免疫6周齡BAI,B/e雌性小鼠,免疫3次后取其脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)

4、胞SP2/0進(jìn)行融合。用建立的間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)4-6次亞克隆,最終獲得4株分泌抗GPV抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1G3、2G8、3B8和3B11。亞類鑒定結(jié)果顯示,1G3和3B11為IgG2b亞類,2G8和388為IgM類。其中1G3和3B11雜交瘤細(xì)胞在體外具有穩(wěn)定分泌抗GPV單克隆抗體的能力,388不穩(wěn)定。Westernblot及間接免疫熒光顯示,4株單抗均能與天然GPV結(jié)合。阻斷結(jié)果表明,1G3和3