禽腺病毒hexon基因克隆表達(dá)及間接ELISA和熒光PCR檢測方法的建立.pdf

1、禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其抗原性的不同可分為3個群，其中Ⅰ群禽腺病毒包含12個血清型。Ⅰ群禽腺病毒含有相同的群抗原，其中比較著名的病毒株有雞胚致死孤兒病毒、鵪鶉支氣管炎病毒、雞包涵體肝炎病毒。所有年齡的家養(yǎng)禽均為易感，臨床和病理癥候群包括肝炎、再生障礙性貧血、出血、輕度呼吸道疾病和產(chǎn)蛋量減少。Ⅰ群禽腺病毒既可水平傳播，也可垂直傳播。 根據(jù)GenBank上的CELO病毒六鄰體(hexon)基因序列，通過軟件比較禽腺病

2、毒hexon氨基酸序列，結(jié)合二維結(jié)構(gòu)圖提示的多肽暴露情況以及抗原性預(yù)測分析，設(shè)計并合成了一對特異性引物，對禽腺病毒1型CELO株的hexon主要抗原性多肽片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與PGEX-4T-1原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.2mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明，表達(dá)的融合蛋白分子量為72.24kD，占全菌蛋白的34％。Western-blotting結(jié)果表明：原核表達(dá)

3、的hexon重組蛋白具有抗原性，能與感染FAV的陽性血清反應(yīng)。 另外，分別用不同濃度的尿素和Triton X-100對hexon重組蛋白進(jìn)行包涵體純化，蛋白的終濃度為30μg/mL。經(jīng)BandScan4.3生物圖象分析軟件分析蛋白的純度為85.0％。達(dá)到較高的濃度和純度，說明本試驗探索的純化方法能有效的純化這些重組蛋白。 其次，將純化的hexon蛋白作為包被用抗原進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，確定其最佳包被濃度

4、為10μg/mL；一抗稀釋度為1：200；HRP酶標(biāo)羊抗雞IgG稀釋度為1：5000，重組蛋白不與NDV、AIV、EDSV、ARV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。本研究初步建立了能檢測FAV抗體的重組蛋白ELISA診斷方法，用這種方法對FAV的12個血清型病毒免疫SPF雞的血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法在FAV抗體檢測方面具有較高的敏感性。 最后，根據(jù)GenBank中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守序列設(shè)計了一對引物，建立

5、了檢測Ⅰ群禽腺病毒12個血清型的SYBR Green Ⅰ熒光PCR方法。以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線。同時進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中各濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系且線性范圍寬；與．AIV、IBDV等非Ⅰ群禽腺病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，靈敏度達(dá)1×102拷貝/μL，表明具有較好的特異性和敏感性；重復(fù)性試驗結(jié)果表明，具有良好的準(zhǔn)確性。本方法從病毒核酸提取至檢測完成僅需5h左右，操作簡便快速，為快速