豬腺病毒3型PCR檢測(cè)方法的建立及Hexon基因克隆分析.pdf

1、豬腺病毒3型(Porcine adenovirus3，PADV-3)是豬腺病毒中最常見(jiàn)的一種血清型，主要引起豬群腹瀉。1964年Haig首次從英格蘭腹瀉仔豬直腸拭子中分離到該病毒，隨后在澳大利亞、美國(guó)、加拿大、西班牙、中國(guó)等國(guó)家相繼被報(bào)道。目前，由于對(duì)PADV-3研究較少，在該病毒結(jié)構(gòu)和功能、診斷方法、流行病學(xué)、致病性等方面均有待深入系統(tǒng)研究。
　　本研究根據(jù)GeenBank中登陸的PADV-3 E1B基因序列(登錄號(hào):AB026

2、117)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小分別為247 bp和194bp。經(jīng)條件優(yōu)化，成功建立了針對(duì)PADV-3 PCR檢測(cè)方法和熒光定量PCR檢測(cè)方法，兩種方法的特異性和重復(fù)性較好，且均具有較高靈敏度，分別最低可檢3.7×105拷貝/μL和3.1×102拷貝/μL。應(yīng)用本研究建立的常規(guī)PCR開(kāi)展PADV-3感染情況調(diào)查，對(duì)從四川省部分地區(qū)收集的283份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PADV-3總陽(yáng)性率為7.

3、07％(20/283)，非腹瀉豬群PADV-3陽(yáng)性率為3.31％，腹瀉豬群中PADV-3陽(yáng)性率為9.87％，顯著高于非腹瀉豬群。應(yīng)用所建實(shí)時(shí)熒光定量PCR開(kāi)展PADV-3感染組織特性研究，對(duì)8頭PADV-3感染陽(yáng)性仔豬相應(yīng)組織器官進(jìn)行采樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，腸粘膜、腸系膜淋巴結(jié)、肺、扁桃體中PADV-3含量分別為2.24×104～6.42×105拷貝/mg、9.49×103～7.36×104拷貝/mg、5.59×103～1.65×105拷貝

4、/mg和9.93×103～1.89×105拷貝/mg，病毒含量顯著高于其它組織器官。
　　根據(jù)GenBank中PADV-3 Hexon基因序列（登錄號(hào):AC000189）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。以陽(yáng)性病料DNA為模板，分段擴(kuò)增克隆，經(jīng)測(cè)序分析，得到Hexon全基因序列（登錄號(hào):KU761583）。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)所獲PADV-3 Hexon全基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所獲Hexon全基因?yàn)?799 bp，編碼932個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為

5、105653.8 u，理論等電點(diǎn)為5.23;該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.92，屬不穩(wěn)定蛋白;且同一氨基酸的不同密碼子的選擇上存在一定的偏向性。該蛋白最大疏水指數(shù)和最小疏水指數(shù)分別為2.289和-3.011，表現(xiàn)一定疏水性;氨基酸中無(wú)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，推測(cè)該蛋白缺乏信號(hào)肽。Hexon蛋白含有25個(gè)絲氨酸、18個(gè)蘇氨酸、21個(gè)絡(luò)氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和35個(gè)抗原位點(diǎn)。將PADV-3克隆株（SCMS01株）與參考株的Hexon基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分