腺病毒分型基因芯片方法的建立與驗(yàn)證.pdf

1、人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)最早發(fā)現(xiàn)于人體扁桃體組織中，是一種無(wú)包膜立體對(duì)稱的二十面體雙鏈DNA病毒顆粒。腺病毒的致病譜與血清型有關(guān)，不同血清型可引起不同疾病，所以我們需要能夠確定其型別的檢測(cè)方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前腺病毒有68個(gè)型別，國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將1-52型劃分為7個(gè)亞屬(A-G)，B亞屬

2、主要包括3、7、14、11和55型，可引起呼吸道疾病。近年來(lái)，腺病毒引起的呼吸道感染疫情時(shí)有暴發(fā)，疫情發(fā)展快、感染性強(qiáng)，病情嚴(yán)重者可危及生命，其早期檢測(cè)和分型也成為醫(yī)務(wù)工作者及研究者們面臨的重要問(wèn)題。目前的檢測(cè)和分型方法中，病毒分離法耗時(shí)太長(zhǎng)，免疫學(xué)方法并不能區(qū)分具體的血清型別。PCR擴(kuò)增法通過(guò)擴(kuò)增特異性基因片段，結(jié)合測(cè)序法確定其型別，但測(cè)序法靈敏度不足，主要用于實(shí)驗(yàn)室研究和新型腺病毒的確定。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增雖靈敏度高，特異性好，但其引物

3、設(shè)計(jì)要求較高且易污染，不能實(shí)現(xiàn)高通量的要求。因此，迫切需要建立一種快速、簡(jiǎn)便的腺病毒分型檢測(cè)方法。
　　本文旨在建立一種腺病毒分型化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測(cè)方法，可對(duì)腺病毒3、7、14、11和55型準(zhǔn)確分型，與病毒分離等方法相比，可縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，為腺病毒分型檢測(cè)提供一種新的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定腺病毒的靶基因，從GenBank中下載特異性基因序列，利用Primer5.0、Clustalx1.8.msw、Alignme

4、n等生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)引物和探針進(jìn)行合成和篩選，制備寡核苷酸基因芯片。運(yùn)用多重不對(duì)稱PCR法擴(kuò)增特異性基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的特異性探針雜交，經(jīng)過(guò)洗滌、化學(xué)發(fā)光顯色后，進(jìn)行結(jié)果分析。在優(yōu)化的多重PCR體系、雜交條件和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條件下，對(duì)芯片的特異性、靈敏性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)檢測(cè)38例臨床樣本，考核基因芯片的實(shí)用性。本研究選取腺病毒的靶基因?yàn)閔exon基因，共篩選出4對(duì)引物和5條探針，3型、7型和14型各一對(duì)引物

5、、11和55型腺病毒共用1對(duì)引物，5種腺病毒各對(duì)應(yīng)1條探針。完成了5種腺病毒質(zhì)粒參考品的構(gòu)建，用質(zhì)粒參考品對(duì)芯片的特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行考核，以質(zhì)粒為模板確定五重PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針雜交后，特異性良好，相互間無(wú)交叉信號(hào)，該基因芯片的最低檢測(cè)限為3×103copies/μl，同一芯片內(nèi)和不同芯片間的重復(fù)性變異系數(shù)CV值均小于15％。38例臨床樣本的分型結(jié)果與測(cè)序法結(jié)果基本一致(37/38)。綜上，本文建