轉(zhuǎn)基因?；蛐酒瑱z測方法的建立.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果o本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：雹氣力日期：卅lf、支3。學(xué)位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存本學(xué)位論文的電子

2、和紙質(zhì)文檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學(xué)位論文的部分或全部內(nèi)容，可以采用影印、復(fù)印等手段保存、匯編本學(xué)位論文。學(xué)校可以向國家有關(guān)機(jī)關(guān)或機(jī)構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密論文，保密期限為年。學(xué)位論文作者簽名：耋令考日期：加JI工妒指導(dǎo)教師簽名：／￡_!之C日期：枷【／r、；Q摘要摘要轉(zhuǎn)基因技術(shù)是把“雙刃劍”在給人類帶來經(jīng)濟(jì)和社會利益的同時，也引發(fā)了許多問題。因轉(zhuǎn)基因

3、動物是人類將所需要的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入受體體內(nèi)所得，并非自然界本來存在，所以比自然界本來存在的生物更具生存優(yōu)勢和競爭力，同時也加大了它的潛在威脅。短期內(nèi)轉(zhuǎn)基因動物對人類健康的直接影響較小，但是長期、潛在的影響還很難定論；其可能還會通過跨物種感染影響生態(tài)環(huán)境和生物多樣性，因此轉(zhuǎn)基因動物的安全性有待進(jìn)一步考察。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物商品化的范圍會逐步擴(kuò)大，為做到防患于未然，有必要進(jìn)行科學(xué)的檢測。目前GMO的檢測主要集中在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)

4、品方面，轉(zhuǎn)基因動物的檢測體系還未建立完善，因此對轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品檢測方法的研究在口岸未來的監(jiān)測工作中具有一定的意義。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測目前主要是以PCR為主的DNA檢測方法和蛋白質(zhì)檢測方法，一次只能檢測一個基因或一種樣品，已不能滿足現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類和數(shù)量不斷增多的現(xiàn)狀。寡核苷酸基因芯片因具有高通量、微型化的特點(diǎn)，可以對同一轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行不同方面的分析以及對多種轉(zhuǎn)基因樣品同時進(jìn)行檢測，適合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測本研究是應(yīng)用基因芯片結(jié)合多重P

5、CR的方法對轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行檢測，首先根據(jù)能代表種屬特異性的線粒體基因：牛線粒體16srRNA基因(BOSmtDNAl6srRNA，BOS)、羊線粒體12srRNA基因(OvismtDNAl2srRNA)、豬線粒體NADH5基因(SusNADH5)；和轉(zhuǎn)基因動物常用的標(biāo)記基因：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(NPTII)、綠色熒光蛋白編碼基因(EGFP)；以及特異的外源轉(zhuǎn)入基因：人乳鐵蛋白編碼基因(HumanLactoferringene，hLF

6、)、人a礙L清蛋白編碼基因(Humana—Lactalbumingene，haLALBA)基因、人溶菌酶編碼基因(HumanLysozymegene，hLYZ)，應(yīng)用DNAstar、Primer50、MEGA、DNAMAN、AnnIIyb等生物學(xué)軟件比對、篩選設(shè)計(jì)了8對符合多重PCR的特異性引物和16條特異性基因芯片70mer探針，均具有良好的特異性。通過對該方法擴(kuò)增條件的優(yōu)化，成功建立多重PCR方法。通過對多重不對稱PCR上下游引物比

7、例的優(yōu)化，雜交體系、雜交條件的優(yōu)化，洗滌條件的優(yōu)化，建立了一種轉(zhuǎn)基因牛檢測型基因芯片，試驗(yàn)結(jié)果表明針對8種基因的16條特異性探針均得到了較好的雜交結(jié)果，特異性強(qiáng)，與轉(zhuǎn)人防御素3基因奶牛樣品、轉(zhuǎn)omega3基樣品等均無交叉反應(yīng)，靈敏度高，檢測極限達(dá)lpg，適合轉(zhuǎn)基因牛的檢測。本研究建立了一種轉(zhuǎn)基因牛基因芯片檢測方法，不僅可以對牛、羊、豬進(jìn)行動物源性的檢測，還可以篩查轉(zhuǎn)基因牛樣品，又可以進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因牛外源基因。本研究是對轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)