九種發(fā)熱伴出疹病原體基因芯片檢測方法的建立.pdf

1、目的：發(fā)熱伴出疹性疾病（RFIS）是以發(fā)熱和出疹為主要臨床癥狀，伴有全身或局部皮膚及粘膜出疹，并可能引發(fā)其他臨床癥狀的一系列疾病的總稱，包括麻疹、風(fēng)疹、傷寒、猩紅熱、流行性出血熱、斑疹傷寒、流行性腦脊髓膜炎、水痘、帶狀皰疹、天花等，已經(jīng)列入我國重點監(jiān)測的傳染性疾病的范疇之內(nèi)。導(dǎo)致該類疾病的病原體包括病毒和細(xì)菌兩大類，主要有麻疹病毒、腸道病毒、風(fēng)疹病毒、登革熱病毒、人類小DNA病毒B19、水痘-帶狀皰疹病毒以及溶血性鏈球菌、傷寒沙門氏菌。

2、這些病原體多數(shù)在潛伏期或臨床癥狀不明時已具有傳染性。目前發(fā)熱伴出疹性疾病的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、PCR法和免疫學(xué)診斷法，這些方法均不能滿足同時檢測多種病原體的需要。本文研究目的是建立一種能準(zhǔn)確、同時、快速的檢測九種發(fā)熱伴出疹病原體的化學(xué)發(fā)光基因芯片的方法，即腸道病毒71型、登革熱病毒、風(fēng)疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、人類小DNA病毒B19、柯薩奇病毒A16型、A組β型溶血性鏈球菌、傷寒沙門氏菌。
　　方法：通過文獻(xiàn)調(diào)研確定

3、待檢測的病原體及其病原體的靶基因，從每個病原體靶基因的高度保守區(qū)序列中設(shè)計引物與探針，并篩選出特異性的引物和探針。進(jìn)行多重不對稱PCR擴(kuò)增，將帶有標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與帶有特異性探針的芯片雜交，經(jīng)洗滌，化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。優(yōu)化多重PCR體系、擴(kuò)增條件、雜交條件以及化學(xué)發(fā)光檢測條件后，評價該芯片的特異性、重復(fù)性和靈敏度。用實時熒光PCR法與芯片法分別檢測腸道病毒EV71梯度稀釋的核酸，比較兩種方法的靈敏度。并利用該方法對74例發(fā)熱伴出疹

4、性疾病的實際臨床樣本進(jìn)行檢測以評價其實用性。
　　結(jié)果：完成了九種發(fā)熱伴出疹病原體基因芯片檢測方法的建立。1.根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計的調(diào)研結(jié)果最終確定九種待檢測的病原體：麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腸道病毒71型、登革熱病毒、人類小DNA病毒B19、柯薩奇病毒A16型、A組β型溶血性鏈球菌和傷寒沙門氏菌。共篩選出了11條特異性檢測探針和9對特異性擴(kuò)增引物。2.構(gòu)建了這九種病原體的質(zhì)粒參考品，并成功構(gòu)建了麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、柯薩

5、奇病毒A16型、腸道病毒71型、登革熱病毒這五種RNA病毒的體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品。3.優(yōu)化后的多重PCR體系分為A、B兩管，在優(yōu)化好的多重PCR體系、雜交條件以及檢測條件下，該芯片顯示出良好的重復(fù)性、特異性以及靈敏度。4.質(zhì)粒參考品和體外轉(zhuǎn)錄 RNA參考品的最低檢測限均達(dá)到3×103copies/反應(yīng)，芯片法比實時熒光PCR法的靈敏度低10倍，但芯片具有明顯的高通量優(yōu)勢。5.74例臨床樣本的檢測靈敏度為95.00%，檢測特異性為100.