蚊媒病原體綜合檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、蚊媒病是一組以蚊蟲為媒介而傳播的疾病，包括瘧疾、淋巴絲蟲病、黃熱病、登革熱、流行性乙型腦炎、西尼羅熱等，是重要的公共健康問題。隨著全球氣候逐漸上升、城市化進(jìn)程的加快、旅游和貿(mào)易的快速發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的不斷變化，全球蚊媒傳染病發(fā)病呈上升趨勢，原有疾病的流行區(qū)域不斷擴(kuò)展、疾病的流行頻度不斷增加。隨著疾病譜發(fā)生變化，相應(yīng)的檢測和監(jiān)測技術(shù)要及時跟進(jìn)，以適應(yīng)新的疾病監(jiān)測需求。檢測及監(jiān)測蚊蟲攜帶的病原體，在傳染病監(jiān)測中屬于早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方

2、法，對于蚊媒傳播疾病的有效預(yù)警和控制有重要的意義。以往的研究都是針對一種病原體檢測，且有些檢測方法靈敏度不夠高,不能夠早期發(fā)現(xiàn)蚊媒傳染病的流行；此外，從生物學(xué)分類角度來看，蚊媒病病原體涉及微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)專業(yè)，目前蚊媒病監(jiān)測也是針對單病種，不同病原體分類專業(yè)人員分別從自身專業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行檢測，浪費(fèi)人力、財(cái)力，且各專業(yè)獨(dú)力實(shí)施，不利于高效、綜合采取防治措施。因而，對于蚊媒病的防治應(yīng)當(dāng)綜合考慮。本研究設(shè)計(jì)對野外采集的蚊蟲綜合檢測多種攜帶的病原

3、體，如黃病毒屬病毒、瘧原蟲和絲蟲。將野外采集蚊蟲樣本同批次處理后高通量檢測，經(jīng)濟(jì)、高效檢測蚊傳病原體，其研究結(jié)果可為衛(wèi)生防病部門提供簡化的檢測、監(jiān)測步驟和程序，提高效率和減少重復(fù)工作量。以黃病毒屬病毒保守性最高的非結(jié)構(gòu)蛋白5 （nonstructurAlprotein，NS5）基因?yàn)榘谢?，根?jù)GenBank中已報(bào)道30多種蚊媒黃病毒屬病毒日本腦炎病毒組（JapaneseEncephalitis Virus Complex），包括日本（

4、乙型）腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus, DenV)、黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)、西尼羅病毒（West Nile virus, WNV）等病毒 NS5基因序列，用DNAStar 軟件設(shè)計(jì)出3 條半巢式PCR通用引物，以JEV cDNA、DenV I～I(xiàn)V 型cDNA為模板優(yōu)化反應(yīng)條件，建立反轉(zhuǎn)錄半巢式PCR （RT-hemi-n

5、ested PCR）方法；以日本腦炎病毒減毒活疫苗(SA14-14-2株)測定該方法的敏感度，結(jié)果顯示，RT-hemi-nested PCR 方法的最低病毒檢出濃度為5.0×10-4 PFU/m1，靈敏度與同類方法相比高出一個數(shù)量級。根據(jù)GenBank中瘧原蟲（包括惡性瘧原蟲﹑間日瘧原蟲﹑三日瘧原蟲﹑卵形瘧原蟲﹑諾氏瘧原蟲等）SSUrRNA基因和絲蟲（馬來絲蟲，犬惡絲蟲等）線粒體基因保守區(qū)的序列，用DNAStar 軟件設(shè)計(jì)6 條半巢式多

6、重PCR通用引物。以惡性瘧原蟲﹑間日瘧原蟲﹑馬來絲蟲DNA為模板優(yōu)化反應(yīng)條件，建立半巢式多重PCR 方法，然后以惡性瘧原蟲DNA、馬來絲蟲DNA 測定該方法的敏感度。并用該方法檢測實(shí)驗(yàn)室感染約氏瘧原蟲的大劣按蚊。所建立的半巢式多重PCR 方法檢測瘧原蟲下限為0.53個惡性瘧原蟲, 絲蟲檢測下限為0.01條馬來絲蟲。該方法可以明確地檢測出大劣按蚊中感染的約氏瘧原蟲子孢子。選擇云南普洱周邊地區(qū)作為蚊媒觀察點(diǎn)采集蚊蟲。按照采集時間將蚊蟲每10

7、只分為一個混合樣本組，樣本少時則每組少于10只。用上述建立的蚊媒黃病毒屬RT-hemi-nested PCR 檢測了54組三帶喙庫蚊蟲樣本，其中14組為陽性，經(jīng)測序確認(rèn)9組為乙型腦炎病毒﹑3組為登革熱II 型病毒﹑1組為登革熱I 型病毒﹑1組未知病毒(與Quang Binh virus 相似度最高，為82％)。上述病毒的最小感染率分別為16.7‰，5.55‰，1.85‰和1.85‰。用半巢式多重PCR 檢測了148組按蚊和三帶喙庫蚊樣本

8、檢測瘧原蟲和絲蟲，未發(fā)現(xiàn)陽性擴(kuò)增。本研究針對蚊媒病防治中的關(guān)鍵需求，建立了一套黃病毒屬病毒、瘧原蟲、絲蟲簡單、有效、高通量的檢測方法，該方法可用于大批量的檢測野外采集的蚊蟲。經(jīng)現(xiàn)場蚊蟲檢測，在云南普洱周邊采集的蚊蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)日本腦炎病毒﹑登革病毒I 型和II型和未知病毒（屬于黃病毒屬）。說明在當(dāng)?shù)厝巳夯騽游矬w內(nèi)，存在這些黃病毒屬日本腦炎組病毒的低度流行。該研究結(jié)果應(yīng)當(dāng)引起疾病控制有關(guān)部門的重視，并對這些地區(qū)以及其他類似地區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步的監(jiān)測