Multiplex PCR-RLB檢測(cè)常見(jiàn)性病病原體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立和評(píng)價(jià)一個(gè)新的多重PCR-反向線點(diǎn)雜交技術(shù)(mPCR/RLB)檢測(cè)常見(jiàn)性傳播疾病(STD)病原體的方法。 方法： 1．利用http://www.angis.org.au網(wǎng)站，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得試驗(yàn)菌株沙眼衣原體(CT)隱蔽質(zhì)?；?、淋病奈瑟菌(NG)的16S rRNA和Opa基因、3種支原體(人型支原體(Mh)，解脲脲原體(Uu)，微小脲原體(Up))的16S-23S rDNA間隔序列和6種

2、念珠菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌)的5.8S-28S rDNA間隔序列的核苷核酸序列。分別設(shè)計(jì)CT和NG的特異性引物及檢測(cè)探針。并用Pretty將6種念珠菌以及3種支原體的間隔序列分別進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)其相應(yīng)屬通用引物和各菌種的特異性寡核苷酸探針，使各引物及探針的Tm值等參數(shù)盡量一致。 2．建立PCR/RLB檢測(cè)6種常見(jiàn)念珠菌，對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)(包括特異性、敏感性等)，并與涂片法、

3、培養(yǎng)法鑒定結(jié)果(Merieux Vitek)進(jìn)行比較。 3．建立mPCR/RLB同時(shí)檢測(cè)CT、NG、Uu、Up和Mh等5種性病病原菌，并與熒光定量PCR(FQ-PCR)和支原體液體培養(yǎng)法進(jìn)行比較。 結(jié)果： 1．PCR/RLB檢測(cè)上述6種念珠菌的敏感性為10 CFU/ml。通過(guò)對(duì)100株念珠菌分離株的檢測(cè)，與培養(yǎng)法(Merieux Vitek)比較表明，有97株與培養(yǎng)法鑒定結(jié)果一致，另外3株通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)與PC

4、R/RLB檢測(cè)結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)200例女性陰道試子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，PCRfRLB的陽(yáng)性率為49％，而涂片法和培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別為27％和39％，明顯高于涂片法和培養(yǎng)法(P<0.05)。 2．mPCR可同時(shí)擴(kuò)增CT、NG、Uu、Up和Mh標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，其PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度為208bp～414bp。97份FQ-PCR CT陽(yáng)性標(biāo)本中有93份經(jīng)mPCR/RLB檢測(cè)為CT陽(yáng)性，45份FQ-PCR CT陰性標(biāo)本中35份mPCR/RLB陰