傳染病病原體診斷

1、傳染病病原體的診斷技術(shù),,,,Friend or Foe?,Rotavirus,Ebola virus,Bacterium,Algae,Protozoan,Virus,1973年以來(lái)部分新發(fā)的傳染病,1973 輪狀病毒 嬰兒腹瀉的主要病因 1975 細(xì)小病毒819 5號(hào)病，慢性溶血性貧血的再障危象 1976 隱孢子蟲(chóng)

2、 隱孢子蟲(chóng)病，急性小腸結(jié)腸炎 1977 埃博拉病毒 埃博拉出血熱 1977 嗜肺軍團(tuán)菌 軍團(tuán)病 1977 漢坦病毒 腎綜合征出血熱 1977 空腸彎曲桿菌 空腸彎曲菌腸炎 1977 丁型肝炎病毒 丁型

3、肝炎 1980 嗜人T細(xì)胞病毒I型 T細(xì)胞淋巴瘤／白血病 1981 金黃色葡萄球菌產(chǎn)毒株 中毒性休克綜合征 1982 大腸埃希菌O157：H7 出血性結(jié)腸炎 1982 嗜人T細(xì)胞病毒11型 毛細(xì)胞白血病 1982 伯氏疏螺旋體 萊姆病 1983 人類(lèi)免疫缺陷病毒

4、 艾滋病(HIV),1973年以來(lái)部分新發(fā)的傳染病(續(xù)),1983 幽門(mén)螺桿菌 消化性潰瘍病1986 環(huán)孢子球蟲(chóng) 環(huán)型孢子蟲(chóng)病(頑固性腹瀉)1988 人皰疹病毒6型 突發(fā)性玫瑰疹1989 丙型肝炎病毒 丙型肝炎1990 戊型肝炎病毒 戊型肝炎1992

5、 0139霍亂弧菌 O139霍亂1992 巴爾道氏體 貓抓病，桿菌性血管瘤病1993 漢坦病毒分離株 漢坦病毒肺綜合征1994 Sabia病毒 巴西出血熱1994 新變異型克雅氏病(人類(lèi)瘋牛病) 1985年瘋牛?。ㄅ：＞d狀腦炎BSE） --1994年出現(xiàn)首例nvCJD--20

6、19年提出nvCJD概念 病原為朊蛋白PrP（英）2019 庚型肝炎病毒 庚型肝炎2019 H5N1禽流感病毒 人禽流感2019 Nipah病毒 尼巴病毒性腦炎2019 西尼羅病毒 西尼羅病毒性腦炎2000 裂谷熱(Rift Valley)病毒 裂谷熱2019 SARS冠狀

7、病毒 SARS（傳染性非典型肺炎）,大部分人類(lèi)致命性疾病均是由動(dòng)物傳播，包括現(xiàn)正肆虐全球的禽流感。每年至少有一種新病原體，包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、原生動(dòng)物和真菌等從動(dòng)物傳染給人類(lèi)。前所未有的速度產(chǎn)生突變，并傳給人類(lèi)，就如艾滋病、馬爾堡出血熱、SARS以及現(xiàn)正肆虐全球的禽流感等難抗病毒。研究人員分辨1407種令人類(lèi)生病的病原體，發(fā)現(xiàn)其中至少800種越過(guò)種物界線，由動(dòng)物傳至人類(lèi)。,新發(fā)傳染?。瓌?dòng)物傳播,

8、與人類(lèi)行為及環(huán)境的改變有關(guān),過(guò)去25年來(lái)曾出現(xiàn)38種新病原體襲擊人類(lèi)，其中四分三為源自動(dòng)物的疾病，包括艾滋病、馬爾堡出血熱、SARS及禽流感等。叢林打獵、密集耕種、全球變暖及長(zhǎng)途旅行的普及，增加疾病跨種物傳播的機(jī)會(huì)，使動(dòng)物身體上的病原體容易產(chǎn)生突變，感染人類(lèi)。一個(gè)典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上發(fā)現(xiàn)的一種病毒，其后傳播至人類(lèi)身上，更演變成世紀(jì)絕癥。,,新病原體的特征,現(xiàn)時(shí)人類(lèi)新傳染病的病原體，多屬于核糖核酸(RNA)病毒類(lèi)

9、，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短時(shí)間內(nèi)發(fā)生突變，并容易適應(yīng)新宿主，令跨種物傳播機(jī)會(huì)變得更大。,人類(lèi)與傳染病較量中的四方面重大突破,隔離檢疫制度的建立;病原微生物的發(fā)現(xiàn);特效藥物的出現(xiàn);疫苗的誕生 .,快速診斷是關(guān)鍵,在人類(lèi)與傳染病的斗爭(zhēng)中，診斷、治療和預(yù)防是三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，及時(shí)正確診斷最為關(guān)鍵，是有效治療的基礎(chǔ)，也是制定預(yù)防策略的依據(jù)。 及時(shí)發(fā)現(xiàn)、有效鑒別、快速診斷和提出預(yù)警，這是現(xiàn)代傳染病防治體系的最前沿 對(duì)已知傳

10、染病要盡快明確診斷 對(duì)未知新發(fā)傳染病要查病因,傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷,一般檢查;生化檢查;病原學(xué)檢查;免疫學(xué)檢查;病理組織檢查;影像學(xué)檢查.,傳統(tǒng)的和常規(guī)的病原學(xué)診斷,分離培養(yǎng)(細(xì)胞,組織動(dòng)物);顯微鏡檢查(光學(xué)和電子顯微鏡);抗原成分檢測(cè)(ELISA,免疫熒光等);分子生物學(xué)基因診斷(核酸雜交,PCR等);,Electronmicrographs,Adenovirus,Rotavirus,(courtesy of

11、Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.),免疫熒光檢測(cè),Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC),(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital),細(xì)胞病變效應(yīng) (cpe),Some viruses kill the cells in wh

12、ich they replicate, often easily visible as cpe, other viruses produce little or no cpeTypically rounding or detaching of cells and cell fusion (syncytia),From Principles of Virology , Flint et al ASM press,From Princip

13、les of Virology , Flint et al ASM press,實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物,Laboratory animals - animal models of human infection. Historically the only way to study viruses was from animal to animal. Problems - 1) inconvenient and expensive, 2)

14、not a defined system - leads to generation of virus mutants, 3) animal welfare issues, Advantages - 1) some viruses can only be studied in this way, 2) gives unique insight into virus pathogenesisEmbryonated eggs,From

15、 Principles of Virology , Flint et al ASM press,核酸診斷的發(fā)展史,核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸定量分析,核酸的直接檢測(cè) 核酸擴(kuò)增檢測(cè)(PCR)定性PCR 定量PCR,,,核酸分子雜交(nucleic acid molecula hybridization),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,genom

16、e,probe,32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶,genome,genome,genome,probe,probe,probe,檢測(cè)方法：放射自顯影 底物顯色 化學(xué)發(fā)光,,,,,,,,,,,,,常用核酸分子雜交技術(shù),斑點(diǎn)雜交（spot blot hybridization)凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southern blot hybridization)原位雜交（in-sit

17、u hybridization),聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,基本步驟和原理,變性（高溫）,退火（低溫）,延伸（適溫）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,每一循環(huán),模 板,引物,引物,dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶,,,PCR原理和步驟,定量PCR---熒光實(shí)時(shí)定量PCR,Taqman水解探針?lè)s交雙探針?lè)ǚ肿有艠?biāo)（環(huán)性探針）法 Amplisensor能量轉(zhuǎn)換法等,新發(fā)傳

18、染病的病原體？？？,,病原學(xué)發(fā)現(xiàn)的“科赫三定律”,一、每種傳染病必定能發(fā)現(xiàn)其病原體；二、能培養(yǎng)出該病原體的純種；三、以培養(yǎng)出的純種病原體接種于動(dòng)物可以產(chǎn)生相同的病變。,,,,,建立該病原體的鑒定方法,動(dòng)物試驗(yàn)臨床實(shí)驗(yàn)室診斷流行病學(xué)研究等,分離到該病原體,確定一種疾病病原體的基本步驟,最終確定病原體與疾病的病因?qū)W關(guān)系,,,基本思路,回答兩個(gè)問(wèn)題：是否是已知的病原體或其變種？是否是完全未知的一種病原體？基本要求：快、準(zhǔn),已知

19、病原體的快速診斷,高通量的檢測(cè)技術(shù),高通量的病原體篩選技術(shù),病原體核酸的高通量檢測(cè)技術(shù)一：多重PCR（聯(lián)用技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)、 液相芯片技術(shù)）技術(shù)二：病原體基因芯片病原體抗原或抗體的高通量檢測(cè)核心技術(shù)：蛋白質(zhì)芯片,Multiplex PCR-Mass Tag system,多重 PCR-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Lipkin 研究組發(fā)明了一種基于multiplex PCR-MassTag（多重PCR

20、與質(zhì)譜聯(lián)用）的高通量病原體快速篩選技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：由于使用光敏感的分子量標(biāo)簽，增強(qiáng)了multiplex PCR引物設(shè)計(jì)的適應(yīng)性和靈活性，使檢測(cè)通量有大幅度的提高。應(yīng)用質(zhì)譜分析PCR產(chǎn)物上的分子量標(biāo)簽克服了凝膠電泳分辨率的局限或熒光染料種類(lèi)的局限。,1. PCR amplification with conjugated primers90 minutes,,,,2. PCR purification on filter plate30

21、 minutes,,3. Elution into 96-well loading platefor mass spectrometer analysis,96-well thermocycler plate,,B,A,4. Automated sample injection, photocleavageand detection1:30 minutes/sample,,Purified samples,,,,Ultraviol

22、et Light,,,,,,,Cleavage of mass tags from amplicon,,MS,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,,,,,,,Ionization and detection,,,A,B,5. Identification of pathogen by signal analysis,,PCR-Mass Tag system,NUCLEIC ACID CONJUGATED MASS TAGS,

23、,Photocleavable linker and spacer,MS sensitivity enhancer,Variable mass unit,DETECTION OF 58 DIFFERENT MASS TAGS BY APCI-MS,,目前，建立在此技術(shù)上的有呼吸道病原體檢測(cè)模塊（包括19個(gè)病毒和3種細(xì)菌），流感病毒亞型檢測(cè)模塊，出血熱病原體檢測(cè)模塊，痘疹病毒檢測(cè)模塊和腦炎腦膜炎病原體檢測(cè)模塊。盡管目前已開(kāi)發(fā)的分子量標(biāo)簽只

24、有64個(gè)，但根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量范圍，還可有極大的拓展空間，保證了這一技術(shù)具有足夠的發(fā)展前景和潛力。,,應(yīng) 用,RESPIRATORY SYNDROME PANEL,Influenza A MatrixInfluenza A N1Influenza A N2Influenza A H1Influenza A H2Influenza A H3Influenza A H5Influenza B HARSV Group A

25、RSV Group B,MetapneumovirusEuropean strainsAmerican strainsCoV-SARSCoV-OC43CoV-229EHPIV-1HPIV-2HPIV-3HPIV-4HPIV-4aHPIV-4bChlamydia pneumoniaeMycoplasma pneumoniaeLegionella pneumophilaStreptococcus pneumo

26、niaeHaemophilus influenzae,Influenza A H7RhinovirusHerpes Simplex Virus 1, 2Varicella Zoster VirusCytomegalovirusHIV-1HIV-2Measles virusMycobacterium tuberculosisPneumocystis cariniiCoxiella burnetti,Current R

27、espiratory Panel,In Progress,,,,,,EnterovirusAdenovirus,HEMORRHAGIC FEVER PANEL,Ebola virus (Zaire)Ebola virus (Sudan)Marburg virusCrimean-Congo hemorrhagic fever virusRift Valley virusHantaan virusSeoul virusYel

28、low FeverKyasanur Forest virusLassa virus (lineage IV),,Ebola virus (Reston)Junin virus Machupo virusDobrava virusTacaribe virusGuanarito virusSabia virusLCMVChikungunya virus Dengue virus groupBorrelia

29、 burgdorferiHerpes Simplex virus (1, 2)HIV-1, -2Neisseria meningitidisRickettsia Spotted Fever GroupPlasmodium sp,Current Panel,In Progress,,,,,,,,,,,,A,C,B,LabNetwork,Epidemiology Microbiology research servic

30、e training,infectiousagents,samplesclinical data,,,,,,GLOBAL SURVEILLANCE NETWORK,Animal modelsdrugsvaccines,Drosten, HamburgLipkin, New YorkMackenzie, PerthPauli, BerlinPeiris, Hong KongQian, BeijingPerez-B

31、rena, MadridSwanepoel, South AfricaWebster, MemphisWen, Shanghai,Multiplex PCR-XMAP,多重PCR-液芯聯(lián)用技術(shù),Diagram,,,LUMINEX XMAP技術(shù)：多指標(biāo)并行檢測(cè)系統(tǒng)（流式熒光技術(shù)或液芯技術(shù)）,,,,技術(shù),GENOCA Templex? PCR技術(shù):多指標(biāo)并行擴(kuò)增,,,,,,,,,,,,,,Super Primer,Templex? P

32、CR技術(shù)原理,Templex? PCR技術(shù)原理,巢示PCR引物提高了引物間的相容性低濃度的特異性引物降低了反應(yīng)過(guò)程中的背景值.僅有的一條生物素標(biāo)記的引物使得更容易擴(kuò)大生產(chǎn)以及質(zhì)量控制.,流式熒光技術(shù)（液芯）原理——XMAP,熒光編碼微球技術(shù),,,,,,,,,,,,,,,,,,每種微球的地址由兩種紅色熒光顏料的摻入比例唯一決定,顏色編碼的微球,,共價(jià)交聯(lián)技術(shù),反應(yīng)模式,,,,,Multiplex Assays with Color

33、Separetion,Luminex 100多功能流式點(diǎn)陣儀,流式熒光檢測(cè)儀,,,呼吸道感染Ⅰ型11種DNA基因組的病原體,呼吸道感染Ⅱ型13種RNA基因組病毒型病原體,蛋 白 質(zhì) 芯 片,MASATM液相芯片,一. 基本原理 微小的乳膠顆粒（Beads,微球）分別染成不同的熒光色，然后再把針對(duì)不同檢測(cè)物的蛋白（如抗原抗體）以共價(jià)方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對(duì)不同檢測(cè)物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測(cè)物

34、（被測(cè)物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等）。,固定生物分子的微球,懸浮點(diǎn)陣,多分析物組合靈活,The Red Laser is Used to Identify the Bead Code,The Green Laser is Used to Identify the Reporter Signal,液相芯片的特點(diǎn)：    液相芯片的獨(dú)特設(shè)計(jì)使得它擁有常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法所不具備的特點(diǎn)：

35、 1. 重復(fù)性好 2. 通量大 可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析在35-60分鐘內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè) 。,3. 靈活性好 4. 靈敏度高 5. 信噪比好 6. 操作簡(jiǎn)便，不需洗滌，耗時(shí)短  7.液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的 天然構(gòu)象，也更有利于探針和被 檢測(cè)物

36、的反應(yīng),Hybridization Time,% of Maximum,Minutes,MASATM和ELISA靈敏度的比較,基因芯片（Gene Chip）,何謂基因芯片：基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又稱(chēng)DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點(diǎn)與點(diǎn)間距一般小于500µm） 排列在玻璃、硅等載體上，稱(chēng)之為基因芯片。基因芯片的種類(lèi)：

37、按應(yīng)用，基因芯片主要可分為3類(lèi)：1、表達(dá)譜基因芯片：主要用于基因功能研究；2、診斷基因芯片：如肝癌診斷芯片、糖尿病診斷芯片、病原體多基因診斷芯片等：3、檢測(cè)芯片：如商品檢疫芯片、病原體檢測(cè)芯片等。,Viral Pathogen Custom Microarray,病原體診斷基因芯片,High Sensitivity Scanner,0.05 CPSMCPSM - what does it mean?Chromphores per s

38、quare micron0.05 cpsm or 5 molecules of dye per 10 micron pixel.Competitors best is 10 molecules of dye per 10 micron pixel.To achieve high sensitivity:Dynamic AutofocusLaser stability ControlHigh resolution scann

39、ing,0.05 CPSM,Detect 5 dye molecules in 10um pixel,0.1 CPSM,Detect 10 dye molecules in 10um pixel,,,eArray Delivering Custom Content and Formats,,Back,Name Your Design,Select Array Format,Prokaryotic Array Custom Desi

40、gns,AgrobacteriumAnopheles (AG) and Plasmodium (PB)...ie. malaria microarrayArchaeon, Halobacterium sp. Bacillus cereus Bacterial pathogensBifidobacterium longum Bordetella PertussisChlamydophila abortusCulex pip

41、iensCyanobacterium SynechocystisE.ColiErwinia carotovora atroseptica/Solanum tuberosumLactobacillus plantarum Methylobacterium extorquens AM1Plasmodium falciparumPseudomonas aeruginosaS.aureus; N.meningococcus; E

42、.coliSalmonella typhimuriumStaphylococcus aureus,SARS Coronavirus,Human Coronavirus OC43,Human Coronavirus 229E,GreeneChip 1.1,Sample: WNV NY99 100,000 RNA copies/ml32/45 top hits are WNV-specific; remainder are JEV g

43、roup or other flavivirus-genus probes,Collaboration between the Greene Laboratory of Columbia University, ICTV , Northeast Biodefense Center, and Agilent Corporation,Sample: SARS-CoV100,000 RNA copies/ml,GreeneChip 1.1

44、,Columbia (Briese, Lipkin, Liu, Lussier Palacios), ICTV (Büchen-Osmond), and Agilent (Hirschberg) 251,000 sequence database, 1710 vertebrate viruses,未知新病原體的發(fā)現(xiàn),,發(fā)現(xiàn)新病毒的主要技術(shù)路線,表達(dá)cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)寬范圍PCR（基于保守序列的PCR）差異顯示技術(shù)：

45、 代表性差異分析（RDA） 抑制性消減雜交（SSH）序列非依賴(lài)的擴(kuò)增： 隨機(jī)PCR（randome PCR） 序列非依賴(lài)的單引物擴(kuò)增（SISPA）,cDNA 文庫(kù)篩選,cDNA文庫(kù)篩選常被用來(lái)檢出RNA病毒的核酸。收集病毒顆粒（感染組織勻漿過(guò)濾，或者血漿超速離心以收集病毒顆粒），提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成c DNA ,構(gòu)成c DNA表達(dá)文庫(kù)。最

46、常用的表達(dá)型載體是λgt11,插入的c DNA片斷可以融合蛋白形式表達(dá)，保留抗原性。病毒在感染過(guò)程刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，因而常用患者恢復(fù)期的血清對(duì)c DNA庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選。,HCV的發(fā)現(xiàn),1989年Choo等小組從被感染的黑猩猩的血漿中用超離心的方法收集病毒顆粒，提取核酸（包括RNA和DNA），充分變性后逆轉(zhuǎn)錄c DNA，構(gòu)建λgt11 c DNA表達(dá)文庫(kù)。用慢性非甲非乙肝炎患者的血清篩選庫(kù)，結(jié)果得到一個(gè)反應(yīng)性克隆。該c D

47、NA克隆與正常人的DNA不雜交，說(shuō)明他來(lái)源于外源基因組。與被感染黑猩猩的肝組織RNA雜交，與未感染黑猩猩的肝組織RNA不雜交，提示該因子可能就是輸血相關(guān)肝炎的一種致病因子。發(fā)現(xiàn)該c DNA克隆僅與被感染黑猩猩的肝組織RNA雜交，而與DNA不雜交，提示該因子是一種RNA病毒。序列分析表明屬于黃病毒科，命名為HCV。,基于保守序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Consensus Sequence Based PCR）,基本原理：基于保守序列的聚合

48、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)保守序列PCR）就是通過(guò)已知的一種生物和另一種生物之間高度保守的DNA序列設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法去擴(kuò)增另一種生物的未知DNA 序列。當(dāng)一種未知病毒與可能與另一種已知的病毒相似時(shí)，可以根據(jù)已知病毒的保守序列設(shè)計(jì)引物，然后用PCR方法擴(kuò)增出未知病毒的相應(yīng)序列。,新型漢坦病毒的發(fā)現(xiàn),1993年5月，在美國(guó)西南部爆發(fā)了一場(chǎng)高死亡率的急性呼吸道疾病。血清學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。病人的血清能與一些已知的漢坦病毒抗原起交叉反應(yīng)，提示該病的

49、病原體有可能是一種以前未能發(fā)現(xiàn)的新漢坦病毒。1993年Nichol等根據(jù)已知的漢坦病毒基因組M片斷的包膜糖蛋白G2編碼區(qū)的保守部位設(shè)計(jì)了PCR引物，擴(kuò)增出一個(gè)278bp的DNA片斷。序列分析表明，與其他個(gè)血清型的漢坦病毒至少有30%的不同源性，在系統(tǒng)發(fā)生上與IV型希望山病毒（Prospect Hill virus,PH）最為接近，說(shuō)明該病毒是一種新的漢坦病毒。,基于保守序列的PCR,技術(shù)要點(diǎn)---引物設(shè)計(jì)一種是簡(jiǎn)并PCR，其所用的是

50、一個(gè)混合的引物庫(kù)，包含了已知某種病毒高度保守氨基酸區(qū)域的所有可能的核苷酸序列 （設(shè)計(jì)引物之前，列出該病毒家族所有成員的對(duì)比圖 ），但簡(jiǎn)并度很高時(shí)有效引物的濃度不足。另一種是根據(jù)密碼子的偏向性設(shè)計(jì)單一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，選擇每個(gè)氨基酸最常用的密碼子組成一條完整的引物。適用于分離親緣關(guān)系較近的相關(guān)序列，但對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的序列則不能檢出。,簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì),目前已經(jīng)可以有計(jì)算機(jī)軟件來(lái)設(shè)計(jì)，常用的軟件有: Primo Dege

51、nerate 3.4 Genefisher CODEHOP Simple degenerate primer(U : Oregon),差異顯示技術(shù)（differential display),最先是Liang和Pardee等提出用于比較兩種細(xì)胞或同種細(xì)胞在不同狀態(tài)下mRNA表達(dá)差異的技術(shù);現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了多種分離和鑒定差別表達(dá)基因的技術(shù)，其中代表性差異技術(shù)(RDA)和抑制消減雜交技術(shù)(SSH)以其靈敏度高、假陽(yáng)性率

52、低和重復(fù)性好而相對(duì)更受歡迎,代表性差異分析（Representational Difference Analysis ,RDA）,基本原理：病原微生物感染靶器官或組織時(shí)，同時(shí)帶入自己的基因組，這樣病理組織就比正常組織多出了病原體基因組。RDA可以把單拷貝的外源基因組從高度復(fù)雜的人染色體DNA本底中檢測(cè)出來(lái)。,RDA流程,分別提取實(shí)驗(yàn)組(Tester)和對(duì)照組(Driver或驅(qū)動(dòng)子)的總RNA或者DNA用四堿基內(nèi)切酶充分酶切，分別連上

53、寡核苷酸接頭，并用特異性的接頭引物擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物去除接頭，再在實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增子上連上新接頭，將兩份擴(kuò)增子雜交，以新接頭為引物進(jìn)行擴(kuò)增只有那些未能與驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增子雜交而自身退火的樣品DNA的兩端因都能與引物配對(duì)才以指數(shù)形式擴(kuò)增，而待檢樣品單鏈DNA和驅(qū)動(dòng)樣品DNA只有一端與引物配對(duì)而線性擴(kuò)增,GBV病毒的發(fā)現(xiàn),GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先報(bào)道。后研究表明GB肝炎因子不同于甲-戊型肝炎病毒。2019年Simons等用GB肝炎因

54、子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血漿，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作RDA分析，7個(gè)cDNA克隆序列分析表明，屬于兩種黃病毒，與HCV有一定同源性命名為GBV-A和GBV-B。,RDA的缺點(diǎn),其本身不能消除不同mRNA分子豐度的差異,因而往往需要進(jìn)行多輪雜交而每輪雜交都涉及到接頭的連接和去除效率問(wèn)題以及綠豆核酸酶消化去除單鏈等操作,抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）,2019年Diatchenko等將抑制性PCR和減法雜交結(jié)

55、合起來(lái)，創(chuàng)立了SSH技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)接頭特異性的引物選擇性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因片段的同時(shí)，可以抑制非靶片段的擴(kuò)增。利用雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理巧妙地在減法雜交過(guò)程中消除了不同mRNA分子間豐度的差異，因而通過(guò)一次減法雜交可將差異片段富集1000倍以上。一般只需兩輪雜交，3-4天即可得到幾十或上百個(gè)差異片段,SSH的基本步驟,RDA與SSH,原理相似：都是建立在PCR技術(shù)和減法雜交的基礎(chǔ)上。RDA是先對(duì)樣品的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增再雜交，而SSH則

56、是先減法雜交再擴(kuò)增。兩者都具有高效、重復(fù)性好、陽(yáng)性率高等優(yōu)點(diǎn)。 共同的缺點(diǎn)：由于驅(qū)趕子和待檢測(cè)的標(biāo)本的背景往往不完全相同，富集的差異片段可能不是微生物學(xué)鑒別的有用標(biāo)記。,最新的技術(shù),序列非依賴(lài)的擴(kuò)增法：隨機(jī)PCR(random PCR)技術(shù)序列非依賴(lài)的單引物擴(kuò)增(SISPA: sequence independent single primer amplification）,Random PCR,基本原理：在合成隨機(jī)引物時(shí)在其加上

57、一個(gè)相同的接頭，這個(gè)接頭含有一個(gè)限制性的酶切位點(diǎn)可以便于隨后的片斷克隆進(jìn)載體，然后對(duì)插入序列測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)即可初步獲得未知病毒的種系來(lái)源信息。這種隨機(jī)PCR法不僅可以檢出DNA病毒也可以檢出RNA病毒。利用這種方法Allander等在2019年在呼吸道感染的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了一種人的parvovirus；Stang A等也在2019年使用這種方法在慢性疲勞綜合癥的病人漱口液中意外檢測(cè)出了HSV-1型病毒。,SISPA,SISPA

58、是單引物擴(kuò)增法中最常用的一種方法，用于鑒定低濃度的未知序列的病毒核酸?；驹恚簩?duì)基因組DNA常用識(shí)別四個(gè)堿基的酶先切割，然后在雙鏈核酸片段的兩端連接上一個(gè)相同序列的接頭（adaptor），這個(gè)接頭可作為隨后PCR反應(yīng)的引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增。通過(guò)將這些產(chǎn)物克隆即可進(jìn)行測(cè)序。SISPA有很多的衍生方法，主要是通過(guò)對(duì)引物進(jìn)行修飾如引入酶切位點(diǎn)、單鏈接頭或者平頭、粘性末端；或者是未知的病原的核酸通過(guò)不同的酶進(jìn)行切割，所得片斷的兩端引入不同

59、的接頭以提高擴(kuò)增的特異性。SISPA的檢測(cè)低限是106個(gè)拷貝/ml，而它的靈敏度取決于臨床標(biāo)本的種類(lèi)以及未知病毒的屬性。,RDA和SISPA,隨機(jī)PCR方法和SISPA是未知病毒檢測(cè)中操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單的方法，通過(guò)序列非依賴(lài)的擴(kuò)增即可擴(kuò)增出大量的病毒基因片段，但實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)有很多的假陽(yáng)性，主要是因?yàn)榻宇^或隨機(jī)引物的可以非特異性結(jié)合試劑中存在的一些核酸（污染源）。SISPA相對(duì)于隨機(jī)PCR存在接頭連接效率的問(wèn)題。SISPA和隨機(jī)

60、PCR方法的缺點(diǎn)是都很耗精力，因?yàn)楸仨毞治龊芏鄠€(gè)克隆，才可能找到所需要的病原體基因。,實(shí) 戰(zhàn) 舉 例,傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法與最新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,A Novel Coronavirus Associatedwith Severe Acute Respiratory Syndrome,virus-isolation techniques electron-microscopical histologic studiesMolec

61、ular and serologic assays,,,,Primer pair IN-2 (+) 5'GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3'IN-4 (–) 5'TAACACACAACICCATCATCA3'conserved regions of open reading frame 1b,A 405-nucleotide segment,,The Genome sequence

62、of the SARS-associated coronavirus Science 300 (5624), 1399-1404 (2019),Virus isolation ( bronchoalveolar lavage specimen)Viral particles were purified,genetic material (RNA) was extractedRNA was converted to cDNA by

63、random-priming and oligo(dT) primings trategy Size-selected cDNA products were cloned single sequence reads Sequences were assembledRapid amplification of cDNA ends [RACE] to capture the 5 end of the viral genome.,,