輸血相關(guān)傳染病病原體抗體檢測蛋白芯片制備研究.pdf

1、蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列(Protein microarray)，是指以蛋白質(zhì)分子(如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等)作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；捕獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白(存在于血清、血漿、淋巴、間質(zhì)液、尿液、滲出液、細胞溶解液、分泌液等)。 現(xiàn)行輸血相關(guān)傳染病傳染病診斷檢測手段主要是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELIASA)方法，相對于蛋白芯片方法而言，此方法在總檢測時間(To

2、tal time)、需要樣品量(Amount of sample)、總操作步驟(Total steps)、同時檢測樣品數(shù)目(Number of samples in a detemination)、檢出限(Limit of detection)五個方面均有一定不足，所以本著達到節(jié)省時間高通量高靈敏度的目的，本文通過將幾種與輸血相關(guān)傳染病抗原蛋白制備蛋白芯片，通過檢測從醫(yī)院臨床血清標本，建立一種以蛋白芯片方式為診斷檢測途徑的新方法。由于蛋

3、白芯片技術(shù)現(xiàn)行發(fā)展可參考技術(shù)經(jīng)驗缺乏，本文旨在研究在蛋白芯片制備之前，建立初步模型，優(yōu)化各種與成功制備相關(guān)條件，為輸血相關(guān)傳染病傳染病診斷蛋白芯片進入中試打好基礎(chǔ)。 首先利用ELISA間接法建立初步模型，研究可行性；接下來其次利用純化人IgG和人IgM為參考品優(yōu)化調(diào)節(jié)模型蛋白芯片成功制備條件；最后利用已確定優(yōu)化條件，將各種基因工程合成純化抗原蛋白稀釋成特定濃度，用ProSys 5510生物點樣儀(美國Cartesian公司)點制

4、芯片，以Express生物芯片掃描儀(美國Packard公司)掃描抗原抗體結(jié)合情況，Quant Analysis軟件分析結(jié)果。 研究結(jié)果如下： 1.利用自行優(yōu)化建立ELISA乙型肝炎病原蛋白微孔板孔，檢測已收集臨床血清(乙型肝炎陽性血清、健康體檢血清)中相應(yīng)抗體，本體系檢測結(jié)果與ElISA確診陽性、陰性檢測結(jié)果符合率均達到82.5％；通過條件優(yōu)化過程，得到與間接法成功檢測相關(guān)抗體相關(guān)因素如下：抗原稀釋倍數(shù)為500×、一抗

5、待檢血清稀釋倍數(shù)為10×、標記二抗?jié)舛葹?000×、清洗次數(shù)為5×3(5min、3次)。 2.成功制備蛋白芯片體系的優(yōu)化條件以及標準曲線。點制溫度為：22℃；濕度為：(RH)65％；點樣用載體基片為：光學環(huán)氧基片(EPX)；點樣液類型為：EPX對應(yīng)B液：抗原蛋白稀釋液為：碳酸鹽緩沖液(CB)；封閉劑為：含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)：封閉時間為：2h(37℃)；洗滌緩沖液為：含有0.05％Tween-20的

6、PBSt及PBS；洗滌次數(shù)：5min，3次(5×3)；一抗孵育時間為：30min(37℃)；二抗孵育時間為：30min(37℃)；標準曲線芯片成功制備，對待檢血清中抗體可檢測下限為0.05ng/n1。 3.相關(guān)病原體抗原(純化HBcAg、純化HSVⅠ、純化HSV Ⅱ、純化CMV、純化HIV1-2、純化TP、純化HCV、純化TOX)抗體檢測芯片成功制備。陰陽性符合率均達到75.74％；片內(nèi)片間平均重復(fù)率84.05％；平均靈敏度：-抗稀釋度