四種輸血傳染病同步檢測蛋白芯片的研究.pdf

1、目的： 加強(qiáng)血源及血液制品的篩查和監(jiān)控是防止感染血液傳播性疾病的重要手段。目前，在輸血傳播性疾病早期篩查技術(shù)方面，最先進(jìn)、方便的方法是ELISA酶聯(lián)免疫診斷技術(shù)，其主要缺陷是不能同步檢測，測試時(shí)間長、耗費(fèi)試劑多。而芯片技術(shù)由于具有高通量、可平行檢測、用時(shí)少、節(jié)省試劑、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已日益引起醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的關(guān)注。本文將乙型肝炎病毒(HBV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒螺旋體(TP)集成在一起，

2、研制了可供大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室使用的熒光免疫芯片和供社區(qū)、急救現(xiàn)場、床旁檢驗(yàn)、小型門診、尤其是野戰(zhàn)和部隊(duì)基層需要的金標(biāo)免疫芯片，為蛋白芯片開發(fā)適用、擴(kuò)大范圍進(jìn)行了初步研究。 方法： 1.對(duì)封閉液加以選擇，尋找抗原抗體結(jié)合率與信號(hào)強(qiáng)度的最佳方案。 2.對(duì)關(guān)鍵的檢測條件進(jìn)行統(tǒng)一，以滿足多種病原體同步檢測的需要。將反應(yīng)體系的終體積定為25μl，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30min，檢測HBV、HIV、HCV和TP四種標(biāo)準(zhǔn)品，

3、觀察檢測范圍、靈敏度、重復(fù)性。 3.取其它血液傳播性疾病呈陽性的血清32份進(jìn)行檢測，觀察蛋白芯片的特異性。 4.用熒光蛋白微陣列和金標(biāo)蛋白微陣列分別檢測國家參比品并與ELISA檢測試劑盒的結(jié)果比較，觀察兩種檢測方法的結(jié)果有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 主要結(jié)果： 1.方法學(xué)建立 蛋白芯片的制備及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：選擇2％BSA的PBS為實(shí)驗(yàn)的封閉液； 熒光法： HBV檢測范圍：3ng/ml～150

4、ng/mlY=11.972X+179.502 HIV檢測范圍：1.5NCU/ml～100NCU/mlY=20.224X+241.733 HCV檢測范圍：1.5NCU/ml～170NCU/mlY=11.171X+478.018 TP檢測范圍：1.5NCU/m～120NCU/mlY=13.335X+200.358 金標(biāo)法 HBV檢測范圍：5ng/ml～150ng/mlY=3.841X+150.989

5、 HIV檢測范圍：2NCU/ml～100NCU/mlY=6.026X+99.753 HCV檢測范圍：2NCU/ml～170NCU/mlY=4.058X+99.873 TP檢測范圍：2NCU/ml～120NCU/mlY=4.819X+122.45 熒光蛋白微陣列檢測200例健康人血清樣本確定了Cutoff值：HBV:4.25；HIV：2.08；HCV:2.41:TP:1.88。 取HBv(3ng/ml

6、)、HIV(1.5NCU/ml)、HCV(1NCU/ml)和TP(1NCU/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品，熒光微陣列批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.8％、3.6％、6.0％、4.7％，天間變異系數(shù)分別為8.3％、6.8％、8.3％、5.6％。 取HBv(5ng/ml)、HIV(2NCU/ml)、HCV(2NCU/ml)和TP(2NCU/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品，金標(biāo)微陣列批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.8％、4.4％、3.9％、4.5％，天間變異系數(shù)分別為4.9％、5.0

7、％、4.8％、5.7％。 2.方法學(xué)比較 ELISA試劑盒檢測HBV、HIV、HCV和TP四種國家參比品符合率分別為98.75％、97.5％、98.75％、100％。熒光蛋白微陣列符合率分別為93.75％、95％、95％、96.67％。用統(tǒng)計(jì)學(xué)的配對(duì)計(jì)數(shù)資料檢驗(yàn)得：X2=0.5，P=0.125，說明兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ELISA試劑盒檢測HBV、HIV、HCV和TP四種國家參比品符合率分別為96.25

8、％、95％、97.5％、100％。金標(biāo)蛋白微陣列符合率分別為95％、92.5％、95％、93％。用統(tǒng)計(jì)學(xué)的配對(duì)計(jì)數(shù)資料檢驗(yàn)得出：X2=1.33，P=0.171，說明兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.臨床驗(yàn)證 取其它血液傳播性疾病呈陽性的血清合計(jì)32份進(jìn)行檢測，結(jié)果均不能在兩種蛋白微陣列中檢出，證實(shí)了熒光蛋白微陣列和金標(biāo)蛋白微陣列的特異性。 用蛋白微陣列檢測臨床陰性標(biāo)本160份，結(jié)果：熒光蛋白微陣列假陽性11份，

9、金標(biāo)蛋白微陣列假陽性12份。 結(jié)論： 1.在醛基玻片上成功固化了蛋白質(zhì)抗原和抗體，通過封閉等處理，消除了背景的干擾，構(gòu)建了金標(biāo)蛋白微陣列和熒光蛋白微陣列芯片，為熒光和可視化檢測奠定了基礎(chǔ)。 2.構(gòu)建的熒光蛋白芯片是一種特異性較好、速度快、操作簡便、靈敏度高的檢測方法，能夠滿足醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室快速篩檢的需要。 3.運(yùn)用納米金標(biāo)記技術(shù)和銀染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了芯片可視化，能滿足現(xiàn)場篩選、急救現(xiàn)場、床旁檢驗(yàn)、小型門診、野戰(zhàn)