六種蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法的建立.pdf

1、蟲媒病毒(Arthropod viruses)是一大類通過嗜血節(jié)肢動物傳播的病毒,通常引起人類發(fā)熱性和腦炎樣疾病,流行病學呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性與地域性,多爆發(fā)于蚊蟲、蜱類等大量孽生的夏秋季節(jié),嚴重危害人類健康與公共安全。由于一些蟲媒病毒還能通過氣溶膠途徑傳播,也是重要的病毒性生物戰(zhàn)劑。蟲媒病毒包括披膜病毒科、布亞病毒科、黃病毒科在內(nèi)的多種病毒,其中以黃病毒屬病毒感染的危害最大,在我國境內(nèi)主要流行的蟲媒病毒病包括流行性乙型腦炎、森林腦炎、登革

2、熱、新疆出血熱,多是由黃病毒屬病毒感染所致的傳染病。蟲媒病毒的致病機制尚不清楚,目前亦無有效的疫苗和抗病毒藥物。早期、快速鑒定病原體是有效預防和控制蟲媒病毒病的基礎。
　　由于蟲媒病毒感染的臨床表現(xiàn)與流行病學特點相似,因此,準確檢測與鑒定病原體顯得尤為重要。目前,對于蟲媒病毒抗體的臨床檢測技術仍以傳統(tǒng)的免疫熒光(IFA)和ELISA檢測為主,一次反應只能檢測一種病原體。本研究以黃病毒屬的流行性乙型腦炎病毒(JEV)、森林腦炎病毒(

3、TBEV)、登革病毒(DENV)、西尼羅病毒(WNV)和甲病毒屬的西部馬腦炎病毒(WEEV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)為研究對象,建立能同時檢測六種蟲媒病毒抗體的蛋白芯片檢測方法,為蟲媒病毒病的臨床診斷提供新的手段。檢測原理是將病毒特異性診斷抗原作為捕獲抗原點樣制備蛋白芯片,利用抗原抗體反應的原理檢測血清中的病毒特異性抗體,再通過與熒光標記的二抗反應進行結果的分析與判定。目前,國內(nèi)外尚未見到蛋白芯片同時檢測多種蟲媒病毒抗體的報道。

4、r>　　本課題的主要研究結果如下:
　　1、蟲媒病毒候選診斷抗原的表達、純化及鑒定
　　本課題選擇含有誘導中和抗體的抗原表位的重組抗原作為蛋白芯片檢測技術的候選診斷抗原。研究表明,黃病毒屬病毒的EDⅢ蛋白只包含誘導中和抗體的型與亞型特異性抗原表位,不含有誘導產(chǎn)生交叉反應抗體的抗原表位,NS1蛋白可誘導中和抗體,是目前疫苗研究與病毒免疫診斷的研究熱點,PrM蛋白和NS3蛋白在黃病毒屬中保守穩(wěn)定,具有良好免疫原性,這兩個蛋白均有

5、作為病毒診斷抗原的報道。甲病毒屬的E1蛋白含有中和性抗原決定簇,至少有4個非重疊的抗原表位,具有良好的免疫原性,是甲病毒屬病毒免疫學檢測的重要抗原之一。依據(jù)國內(nèi)外對這兩類病毒診斷抗原的研究進展,并結合我國病毒流行株的特點,本課題使用DNAstar與Primer5軟件進行引物設計并添加適當?shù)拿盖形稽c,共設計了針對TBEV、JEV、DENV1、DENV2、DENV3、DENV4、YFV、WEE、EEE、WNV的17對PCR擴增引物。通過構建

6、并鑒定重組表達質粒,在大腸桿菌中共表達了17個重組抗原,并采用鎳離子親和層析的方法進行了抗原的純化。另外,利用滅活病毒免疫大白兔制備動物免疫血清,在完成其效價及特異性鑒定的基礎上,采用ELISA方法通過動物免疫血清鑒定所表達的重組抗原的檢測特異性,共獲得12個具有良好特異性的診斷抗原,為進一步建立蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法奠定了基礎。
　　2、蛋白芯片檢測方法的建立及條件優(yōu)化
　　采用SpotArrayTM24點樣儀將純化后的

7、17個候選診斷抗原作為捕獲抗原點制于晶芯高分子三維基片上制備蛋白芯片,以兔IgG作為陽性對照,以含15％甘油的PBS為陰性對照,每個樣本重復3點,點樣后,玻片室溫下自然風干4h。首先采用兔免疫血清與蛋白芯片進行反應,篩選可用于蛋白芯片檢測方法的特異性良好的診斷抗原。通過分析,共篩選出12個特異性較好的重組抗原,與ELISA法篩選的結果一致,表明將不同病毒的診斷抗原在一張芯片上反應并不影響彼此的檢測特異性。在此基礎上,進行蛋白芯片檢測條件

8、的優(yōu)化,優(yōu)化結果顯示,抗原點樣濃度在0.125～0.6mg/ml之間可獲得良好的檢測特異性,血清檢測范圍可達到1:100～1:1000。蛋白芯片的最佳反應條件芯片封閉時間為2h、Cy3標記的羊抗兔IgG使用效價為1:1000、第二抗體反應時間為45min,蛋白樣本稀釋液中甘油的濃度為15%。在條件優(yōu)化之后,再次用兔免疫血清進行蛋白芯片的驗證,證明用優(yōu)化后的反應條件及篩選到的12個診斷抗原可獲得良好的檢測特異性。
　　3.蛋白芯片檢

9、測方法的考核與驗證
　　建立蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法的最終目的是將其應用于蟲媒病毒感染患者的臨床診斷,為蟲媒傳染病的診斷和治療提供重要的病原學依據(jù)。因此,在建立蛋白芯片檢測方法之后,采用臨床血清標本對芯片的實際檢測效果進行了考核與驗證。共收集了33份疑似森林腦炎病毒感染血清、8份疑似乙型腦炎病毒感染血清、22份疑似登革病毒感染血清,以及20份正常人血清作為陰性對照。首先,采用以滅活全病毒作為抗原的IFA方法對樣本進行了檢測,然后用

10、篩選出的12個診斷抗原作為包被或捕獲抗原,采用ELISA方法和優(yōu)化后的蛋白芯片方法進行了平行檢測,以比較其檢測效果。在33份疑似森林腦炎病毒感染血清中,IFA方法檢測結果為21份IgG抗體陽性,23份IgM抗體陽性;在重組抗原的平行檢測中,ELISA和蛋白芯片的檢測結果均為16份IgG抗體陽性、17份IgM抗體陽性,檢測符合率達到100%;對8份疑似乙型腦炎病毒感染血清的檢測中,IFA檢測到8份IgG抗體陽性,6份IgM抗體陽性,ELI

11、SA法檢測到4份IgG抗體陽性、5份IgM抗體陽性,而蛋白芯片法檢測到5份IgG抗體陽性和5份IgM抗體陽性,檢出率稍高于ELISA法;對22份疑似登革病毒感染血清的檢測結果為:ELISA檢測13份IgG抗體陽性,15份IgM抗體陽性,而蛋白芯片法檢出14份IgG抗體陽性,15份IgM抗體陽性,檢出率稍高于ELISA法。ELISA與蛋白芯片方法檢測出的陽性血清標本編號一致,而且均在IFA檢測的陽性標本范圍中。經(jīng)Kappa檢驗后,證明蛋白

12、芯片與ELISA具有良好的一致性。正常人血清樣本檢測結果均為陰性。蛋白芯片法在檢測出DENV抗體陽性的基礎上,可以同時對標本進行血清學分型。以重組抗原為捕獲抗原的蛋白芯片與ELISA法的陽性檢出率均低于以全病毒為抗原的IFA方法。為提高蛋白芯片方法的敏感性,以TBEV為例,用EDⅢ與NS1抗原組合作為診斷抗原進行檢測,共檢出18份IgG陽性血清和18份TBEVIgM陽性血清,比單一TBE-EDⅢ抗原多檢出IgG抗體陽性標本2份,IgM陽

13、性標本1份,證明應用組合抗原可提高抗體陽性標本的檢出率。
　　通過對診斷抗原的鑒定與篩選以及對蛋白芯片檢測條件的優(yōu)化,本研究建立的6種蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法獲得了較好的檢測特異性與敏感性,對臨床血清標本的檢測特異性達到100%,敏感性稍高于傳統(tǒng)的ELISA法。進一步的研究結果表明,采用組合的診斷抗原,可以提高蛋白芯片的陽性檢出率。與傳統(tǒng)的IFA和ELISA抗體檢測方法相比,蛋白芯片除具有檢測通量高的優(yōu)勢外,還可以節(jié)約檢測成本、縮