豬呼吸道疾病綜合征六種病原基因芯片檢測方法的建立.pdf

1、豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）是由病毒、細菌、支原體、寄生蟲及環(huán)境應激等多種因素引起，以呼吸困難、咳嗽、發(fā)熱、生長遲緩等為臨床特征的一類豬常見疾病。病原學分析發(fā)現(xiàn)，引起PRDC的主要病原包括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）、豬肺炎支原體

2、（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV-2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、豬流感病毒（Swi

3、ne influenza virus,SIV）等，其中APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六種病原在我國較為常見，規(guī)?；B(yǎng)豬中多病原的混合感染或繼發(fā)感染大大增加了臨床診斷的難度。目前，對APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六種病原的檢測多進行單一病原的分離培養(yǎng)、血清學檢測、PCR擴增等，缺少可同步鑒別檢測六種病原的方法。因此，建立一種可同時檢測PRDC六種重要病原的方法，節(jié)省成本，提高檢測效率，對

4、豬病的流行病學調(diào)查、疫病監(jiān)控、進出境檢疫等具有重要意義。本研究以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV作為研究對象，建立了可同步鑒別檢測六種病原的基因芯片，該方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性。其主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.引物和探針的設計
　　根據(jù)GenBank中登錄的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的基因序列，使用生物學軟件Mega5、Primer Premier5.0和Olig

5、o6.0進行分析比對、設計6對特異性引物和多條探針。對六種病原核酸進行PCR擴增，構(gòu)建T-克隆載體，基于電泳檢測和測序比對結(jié)果篩選陽性質(zhì)粒。
　　2.探針篩選和單一病原基因芯片檢測方法的建立
　　參考GeXP的標記方法，對靶序列進行Cy3熒光標記，與固定于醛基基片表面的探針進行避光雜交，掃描雜交結(jié)果，篩選特異性高且熒光信號強的探針。在探針篩選的基礎上，進行退火溫度、外循環(huán)次數(shù)、雜交探針濃度、雜交液、雜交溫度和雜交時間的優(yōu)化，

6、確定退火溫度為56～58℃和外循環(huán)25～30次進行擴增，PCR產(chǎn)物與自配雜交液混合，42℃避光雜交3h。對單一病原基因芯片檢測方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性進行評估，結(jié)果顯示：該方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性，其中敏感性分別為APP2.97×102拷貝/μL、HPS4.38×103拷貝/μL、Mhp8.26×102拷貝/μL、PCV-23.78×102拷貝/μL、PRRSV1.38×103拷貝/μL、CSFV3.32×10拷貝/μL。該方法

7、的檢測敏感性與普通PCR擴增相比高10～100倍。
　　3.六種病原基因芯片單管同步檢測方法的建立和初步應用
　　在單一病原基因芯片檢測方法的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化六種病原特異性嵌合引物的濃度，初步建立六種病原同步檢測的基因芯片方法。優(yōu)化雜交溫度和時間，進行方法評估。
　　特異性試驗：對偽狂犬病病毒、豬細小病毒、日本乙型腦炎病毒、豬水皰病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、藍舌病病毒、小反芻獸疫病毒和沙門氏菌的核酸進行

8、擴增雜交，驗證構(gòu)建芯片的特異性。結(jié)果顯示，該方法與上述病原均無交叉反應。
　　敏感性試驗：將六種病原的陽性質(zhì)粒進行混合后倍比稀釋，以其為模板進行敏感性試驗。結(jié)果顯示：APP5.8×102拷貝/μL、HPS7.8×103拷貝/μL、Mhp6.8×103拷貝/μL、PCV-26.3×102拷貝/μL、PRRSV4.8×103拷貝/μL、CSFV5.5×102拷貝/μL。因此，綜合考慮六種病原的檢出限，多病原單管同步檢測基因芯片的敏感性

9、為103拷貝/μL。
　　重復性試驗：選取同一批次制備的6張基片和不同批次制備的6張基片，進行組內(nèi)和組間重復性試驗。結(jié)果顯示：組內(nèi)組間試驗均具有較高的可重復性。
　　保存期試驗：本試驗進行了為期4個月的保存期試驗，確定芯片的最優(yōu)保存條件。結(jié)果顯示：該方法制備的芯片至少可在-20℃條件下保存4個月。
　　臨床初步應用：對重慶地區(qū)采集的186份樣品分別使用本研究建立方法與現(xiàn)行標準方法進行對比分析，結(jié)果顯示：基因芯片方法檢出