下呼吸道病原菌多重降落PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　建立可于單一體系中同時(shí)直接檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii,Ab)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,sp)、b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的多重降落PCR檢測(cè)方法。并應(yīng)用臨床標(biāo)本與細(xì)菌培

2、養(yǎng)法比較驗(yàn)證所建立的多重降落PCR檢測(cè)方法的靈敏度與特異性。
　　 方法:針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌blaoXA-51-like基因、b型流感嗜血桿菌capⅡ區(qū)、肺炎鏈球菌cpsA基因、Hib capⅡ區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群插入序列IS6110為靶標(biāo)分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物,應(yīng)用Primer-BLAST檢測(cè)引物特異性;根據(jù)所設(shè)計(jì)的相關(guān)引物建立對(duì)應(yīng)的單-PCR,并使用自純培養(yǎng)菌株提取的基因組DNA驗(yàn)證其特異性與檢測(cè)限;在所建立的單一PCR的甚

3、礎(chǔ)上建立多重降落PCR,對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證其檢測(cè)限與特異性;進(jìn)一步使用492份痰標(biāo)本與細(xì)菌培養(yǎng)法比較驗(yàn)證所建立的多重降落PCR檢測(cè)方法的臨床靈敏度與特異性。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)菌培養(yǎng):492份痰標(biāo)本共培養(yǎng)出47份鮑曼不動(dòng)桿菌、25份肺炎鏈球菌、7份b型流感嗜血桿菌、10份結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
　　 2.單一PCR:所建立的鮑曼不動(dòng)桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群單一

4、PCR分別于353 bp、177 bp、653 bp、494 bp處擴(kuò)增出特異性條帶,與其它菌株之間無非特異性擴(kuò)增:相應(yīng)的檢測(cè)限分別為0.82 Pg、0.2 Pg(相當(dāng)于0.2 CFU)、6.3 Pg(相當(dāng)于16 CFU)、0.02 Pg(相當(dāng)于8基因組拷貝)。
　　 3.多重降落PCR:在單一PCR的基礎(chǔ)上成功建立可同時(shí)檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的多重降落PCR檢測(cè)方法,其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌

5、、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測(cè)限分別為8.2pg、2Pg(相當(dāng)于2CFU)、63 Pg(相當(dāng)于160CFU)、0.02Pg(相當(dāng)于8基因組拷貝)。
　　 4.臨床標(biāo)本驗(yàn)證:與細(xì)菌培養(yǎng)法相比,所建立的多重降落PCR檢測(cè)方法對(duì)492份痰標(biāo)本中鮑曼不動(dòng)桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測(cè)靈敏度達(dá)100%,特異性分別達(dá)98%、94%、98%、98%。
　　 結(jié)論:成功建立了可于單