下呼吸道病原菌多重降落PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　建立可于單一體系中同時直接檢測下呼吸道標(biāo)本中鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,Ab)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,sp)、b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的多重降落PCR檢測方法。并應(yīng)用臨床標(biāo)本與細菌培

2、養(yǎng)法比較驗證所建立的多重降落PCR檢測方法的靈敏度與特異性。
　　 方法:針對鮑曼不動桿菌blaoXA-51-like基因、b型流感嗜血桿菌capⅡ區(qū)、肺炎鏈球菌cpsA基因、Hib capⅡ區(qū)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群插入序列IS6110為靶標(biāo)分別設(shè)計4對特異性引物,應(yīng)用Primer-BLAST檢測引物特異性;根據(jù)所設(shè)計的相關(guān)引物建立對應(yīng)的單-PCR,并使用自純培養(yǎng)菌株提取的基因組DNA驗證其特異性與檢測限;在所建立的單一PCR的甚

3、礎(chǔ)上建立多重降落PCR,對反應(yīng)條件進行優(yōu)化,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗證其檢測限與特異性;進一步使用492份痰標(biāo)本與細菌培養(yǎng)法比較驗證所建立的多重降落PCR檢測方法的臨床靈敏度與特異性。
　　 結(jié)果:
　　 1.細菌培養(yǎng):492份痰標(biāo)本共培養(yǎng)出47份鮑曼不動桿菌、25份肺炎鏈球菌、7份b型流感嗜血桿菌、10份結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
　　 2.單一PCR:所建立的鮑曼不動桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群單一

4、PCR分別于353 bp、177 bp、653 bp、494 bp處擴增出特異性條帶,與其它菌株之間無非特異性擴增:相應(yīng)的檢測限分別為0.82 Pg、0.2 Pg(相當(dāng)于0.2 CFU)、6.3 Pg(相當(dāng)于16 CFU)、0.02 Pg(相當(dāng)于8基因組拷貝)。
　　 3.多重降落PCR:在單一PCR的基礎(chǔ)上成功建立可同時檢測鮑曼不動桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的多重降落PCR檢測方法,其對鮑曼不動桿菌

5、、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測限分別為8.2pg、2Pg(相當(dāng)于2CFU)、63 Pg(相當(dāng)于160CFU)、0.02Pg(相當(dāng)于8基因組拷貝)。
　　 4.臨床標(biāo)本驗證:與細菌培養(yǎng)法相比,所建立的多重降落PCR檢測方法對492份痰標(biāo)本中鮑曼不動桿菌、b型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測靈敏度達100%,特異性分別達98%、94%、98%、98%。
　　 結(jié)論:成功建立了可于單