食品中4種病原菌PCR檢測(cè)方法的研究.pdf

1、近年來(lái)，各地食品安全事件呈爆發(fā)性趨勢(shì)，且越演越烈。在這些事件中，食品中病原菌的污染是引起細(xì)菌性食物中毒及相關(guān)性傳染病的主要因素。為預(yù)防和控制此類(lèi)情況的發(fā)生，除做好常規(guī)的消毒、衛(wèi)生等環(huán)節(jié)外，對(duì)食品中病原菌的快速檢測(cè)為防治病原菌引起的食物中毒起到重要的意義。常見(jiàn)的食品及其原料中的病原菌包含有：鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌以及銅綠假單胞菌等。使用目前的檢測(cè)食品中病原菌的方法，應(yīng)對(duì)當(dāng)前日趨復(fù)雜的多菌混合污染，顯得力不

2、從心。故此，建立起一類(lèi)快速、敏捷、精確的檢測(cè)方法已經(jīng)迫在眉睫。鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（PCR）中，多重 PCR是在常規(guī)單一 PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物或（和）不同的模板，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到多個(gè)核酸片斷的PCR反應(yīng)。該方法克服了常規(guī)單一PCR方法由于檢測(cè)項(xiàng)目單一，導(dǎo)致的應(yīng)對(duì)多重污染時(shí)檢測(cè)耗時(shí)、繁瑣等一些缺點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種食品中病原菌快速地同步檢測(cè)。
　　本文研究了一種針對(duì)食品及其原料中的4種病原菌，即金黃色葡萄球菌、志賀氏

3、菌、銅綠假單胞菌及多殺性巴氏桿菌的多重PCR反應(yīng)的檢測(cè)方法。依據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成了用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc基因）、志賀氏菌質(zhì)粒侵襲抗原 H基因（ipaH基因）、多殺性巴氏桿菌菌毛蛋白基因（ptfA基因）以及銅綠假單胞菌外膜蛋白L基因（oprL基因）的4對(duì)特異性引物。本文以退火溫度為主要因素，先進(jìn)行單菌PCR擴(kuò)增的條件優(yōu)化、特異性及敏感性試驗(yàn)。得知，4對(duì)特異性引物分別能擴(kuò)增出280bp

4、、474bp、150bp和331bp的目的基因片段，對(duì)食品中其它的病原菌如鼠傷寒沙門(mén)氏菌、空腸彎桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和致病性大腸桿菌均未擴(kuò)增出目的片段。4個(gè)目的基因PCR反應(yīng)的最佳退火溫度依次為：55℃、54℃、56℃、56℃。敏感性試驗(yàn)中，4菌基因組DNA的檢出限依次為：100pg/μL、1pg/μL、1 pg/μL、10pg/μL。此后，進(jìn)行4菌多重PCR擴(kuò)增的條件優(yōu)化、特異性及敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，多重PCR最佳退火溫度為54℃，特