多重PCR快速檢測乳品中三種病原菌方法研究.pdf

1、分類號：密級：TS2074多重PCR快速檢測乳品方法研究單位代碼：學(xué)號：10086OtO病原菌MultiplexPCRAssayforRapidDetectionofThreeBactedalPathogensinDairyFood學(xué)位申請人：武衛(wèi)影指導(dǎo)教師：張偉教授學(xué)位名稱：工程碩士研究領(lǐng)域：食品工程授予單位：；nIjL農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一二年五月二十日摘要食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，在各種食品安全事

2、件中，細(xì)菌性食物中毒則是食物中毒的重要因素。目前，國內(nèi)檢測食品中病原菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，其操作繁瑣，檢測時(shí)間較長，通常需要35天才能完成，且靈敏度較低。因此，急需建立一種快速有效且通量較高的檢測方法。本文選擇沙門氏菌的invA基因，金黃色葡萄球菌的”甜c基因，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的以fZ基因?yàn)榘谢?，分別設(shè)計(jì)了三對引物，試驗(yàn)過程中對多重PCR反應(yīng)體系中退火溫度、引物添加量、M92濃度、dNTPs濃度及TaqDNA聚合酶添加量等影響

3、因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。研究了引物的特異性，確定了靈敏度，并探索了從食品中提取三種病原菌模板DNA的方法，檢測人工污染樣品，確定了檢出限，并與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行了比較。多重PCR反應(yīng)體系為：10PCRbuffer2此，M92(25mmol／L)llaL，dNTPs(25raM)08IxL，Taq酶(5U／lxL)O3皿，；漠板各2此，上下游引物(10IAmol／L)各O8此，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至25此。多重PC

4、R擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃起始變性5min，94℃變性45S，57℃退火30S，72℃延伸50S，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72。C延伸10rain。反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。三對引物分別能擴(kuò)增出475bp，236bp，127bp的目的條帶，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測序，登錄Genebank將測序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast比對，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究共檢測了18株菌，其中4株沙門氏

5、菌、1株金黃色葡萄球菌、1株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均為陽性結(jié)果；12株其他菌均為陰性結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果表明引物特異性強(qiáng)。確定了多重PCR的靈敏度，單獨(dú)檢測沙門氏菌靈敏度為：102CFU／mL、金黃色葡萄球菌靈敏度為：103CFU／mL、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌靈敏度為：103CFU／mL。同時(shí)能夠檢測出三種病原菌的靈敏度沙門氏菌為：103CFU／mL，金黃色葡萄球菌為：103CFU／mL，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為：103CFU／mL。本研究比較了6

6、種人工污染滅菌奶中模板DNA提取方法，從6種方法中，選取了一種快捷、有效的、適用的DNA提取方法。檢測人工污染樣品確定檢出限，多重PCR方法檢測人工污染巴氏殺菌奶中的三種致病菌，沙門氏菌檢出限為102CFU／mL、金黃色葡萄球菌檢出限為102CFU／mL、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢出限為102CFU／mL。并且檢測可以在6h內(nèi)完成，大大縮短了檢測時(shí)間。對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，建立的多重PCR檢測方法對三種致病菌的敏感性均為100％；特異性：沙門