三種植物病原細菌的實時熒光定量PCR檢測.pdf

1、萎蔫短小桿菌糖甜菜致病變種(Curtobacterium flaccumfaciens pv．Beticola,cfb)是引起糖甜菜(Beta vulgaris var．saccharifera)葉斑病的主要病原物。依據(jù)該病原菌的16S-23S rRNA ITS區(qū)(登陸號為AY191513)在特異性位點用Primer Premier 5.0設(shè)計了一對引物CfbF(5’-TCAGTGCTGGTCGCCCATFAG-3’)和CfbR(5’-

2、AACAA CGTGCACCAGCCAGC A-3')，預(yù)計PCR擴增產(chǎn)物為191 bp。用該引物擴增3個cfb菌株及29個參比菌株，僅靶標菌擴增出191 bp產(chǎn)物；在實時熒光定量PCR檢測體系中，靶標菌株都檢測到較強的信號，熔解曲線為單峰，沒有非特異性擴增。為建立標準曲線將靶標基因組DNA稀釋為0.001 ng，0.01 ng，0.1 ng，1 ng，10 ng共5個梯度，進行實時熒光PCR擴增。回歸方程為y=-0.2741x+7.5

3、1，R<'2>=0.99。 菌株Tc7(Pseudomonas spp．)是從發(fā)病糖甜菜上分離到的另一病原細菌，用16S rRNA通用引物(16sF：5’-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3’和16sR：5’-TCC CCTACGGTTACCTTGTTA -3’)擴增其16S rRNA并測序，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)其與Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas flavescens、Pseudo

4、monas fulva 等多個菌株的16S rRNA序列同源性都很高，幾乎不存在特異性位點。用已報道的真細菌ITS通用引物U1/U2擴增該菌株16S-23S rRNA間的ITS，測得420 bp序列(已登陸至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為EF205021)，在多態(tài)性較為豐富的區(qū)域設(shè)計引物PF(5’- AGGCGCTCAAGCAAATCATAGA-3’)和PR(5’-TTGTTCCCAATCACGTAGGGTG -3')，預(yù)計PCR擴增產(chǎn)

5、物為238 bp。常規(guī)PCR驗證引物特異性，除靶標菌株外其余29個參比菌株均無擴增產(chǎn)物。在實時熒光定量PCR檢測體系中，靶標菌株擴增曲線平滑，熔解曲線主峰明顯，表明沒有非特異性擴增。將靶標基因組DNA依次稀釋10倍，成0.00084 ng，0.0084 ng，0.084 ng，0.84 ng，8.4 ng，84 ng共6個梯度，陰性對照為滅菌超純水。每個處理做兩個重復(fù)，制備標準曲線。每兩個重復(fù)的曲線基本重合，Ct值也十分相近，表明重復(fù)性

6、較好。標準曲線的回歸方程為y=-3.33x+20.42，R<'2>=0.99。該方法適用于糖甜菜葉片上病原物的檢測。 茄青枯茵(Ralstonia solanacearum)能夠引起多種重要作物萎蔫癥狀，是一類重要的的病原菌。本研究用J．Schonfeld等人報道的引物Rsol_fliC建立了對該菌的實時熒光定量PCR(SYBR Green Ⅰ)檢測體系，并制作標準曲線，回歸方程為y= -3.74x+44.15，R<'2>=0.