基于實時熒光定量PCR的植物轉基因檢測技術的改進與應用.pdf

1、轉基因檢測是轉基因研究的必要環(huán)節(jié)。本研究以Micro-Tom番茄和金柑為試材，建立了快速提取DNA用于實時定量PCR檢測轉基因植株和構建重組質粒篩選最佳引物體系，并應用質粒添加實時定量PCR法對轉基因金柑的拷貝數(shù)進行了驗證。主要研究結果如下：
　　 (1)適于實時PCR檢測轉基因的DNA快速制備技術
　　 以番茄葉片為試材，建立了一種簡便快速制備葉片基因組DNA的方法。利用煮沸法提取番茄葉片，可以在30 min內完成12

2、個樣品的DNA制備。同時確定葉片面積大小從2 mm2至50 mm2，在12.5μL的PCR體系中添加0.1μL-0.2μL的DNA模板，均可實現(xiàn)擴增。結果表明，建立的實時定量PCR體系能夠準確的檢測轉基因植株，根據目標基因HPT和內標基因ELIP的Ct差值(△Ct)，應用2(1-△Ct)可以判斷目標基因是否插入。
　　 (2)重組質粒的構建及最佳引物對的篩選
　　 利用分子生物學技術在番茄中構建了包含目標基因HPT和番茄

3、內標基因ELIP的重組質粒HPT-ELIP，并應用10000 copy·μL-1的濃度篩選出適合實時定量PCR的最佳引物對P438+P439和SP061+SP062。同時在金柑中構建了包含目標基因NPTII和金柑內標基因CS的重組質粒CS-NPTII，同時應用10000 copy·μL-1的濃度篩選出實時定量PCR的最佳引物對CS001+CS002和SP069+SP070，用于下一步準確鑒定轉基因金柑拷貝數(shù)。
　　 (3)建立了