轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè).pdf

1、MON88017是Monsanto公司通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將含有cry3Bb1和cp4 epsps兩個(gè)基因表達(dá)盒的質(zhì)粒載體PV-ZMIR39導(dǎo)入玉米Hi-II細(xì)胞中得到的轉(zhuǎn)基因玉米品系。對(duì)MON88017的分子生物學(xué)分析證實(shí)，只有單一拷貝的cp4 epsps和cry3Bb1基因表達(dá)盒整合到MON88017的基因組中的單一位點(diǎn)上；各種表達(dá)元素完好無(wú)損；沒(méi)有任何細(xì)菌質(zhì)粒骨架序列插入MON88017基因組。
　　本實(shí)驗(yàn)采用基因組步移

2、法和巢式 PCR方法測(cè)定出 MON88017外源 DNA導(dǎo)入位點(diǎn)旁側(cè)序列，并根據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化體特異性(event specific)PCR檢測(cè)引物，進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，確定了引物的最佳反應(yīng)條件，從而建立起該轉(zhuǎn)基因玉米品系的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法。在定性PCR基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合適的引物和探針，利用定量 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，確定產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量，從而建立起一套完整的抗蟲(chóng)抗除草劑玉米MON88017

3、及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)體系。詳細(xì)結(jié)果如下:
　　(1)采用基因組步移法和巢式 PCR方法獲得轉(zhuǎn)基因玉米 MON88017外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁側(cè)序列504bp。序列同源性分析表明，從5'端開(kāi)始前168bp為玉米基因組序列，從第169bp至3'末端為插入到玉米中的載體序列，其中從第169bp~479bp為間插序列，從第480bp至3'末端為水稻中啟動(dòng)子 P-ract1部分序列。
　　(2)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米 MON8801

4、7左邊界序列，采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)MON88017轉(zhuǎn)化體特異性引物，對(duì)3對(duì)特異性引物進(jìn)行篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，確定最適的特異性引物MON88017-1F/R(446bp)，其最適退火溫度為56℃。通過(guò)驗(yàn)證，該引物MON88017-1F/R具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。用特異性引物MON88017-1F/R對(duì)不同濃度的DNA進(jìn)行檢測(cè)表明，在MON88017 DNA稀釋至0.1％時(shí)，仍能擴(kuò)增出446 bp的特異性目

5、的片段，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因玉米的最低檢測(cè)極限(即靈敏度)較高，為0.1％。該定性PCR方法完全可以滿足轉(zhuǎn)基因玉米品系的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)的要求。
　　(3)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米 MON88017左邊界序列，采用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)化體特異性定量引物MON88017-F/R(87bp)和Taqman探針MON88017-P，通過(guò)篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，確定其最適退火溫度為60℃。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)，Taqman探針