轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯與阪崎腸桿菌的熒光PCR和數(shù)字PCR檢測(cè).pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因的安全性成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，各國(guó)都相繼出臺(tái)了關(guān)于標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的法規(guī)，而市場(chǎng)準(zhǔn)入的關(guān)鍵就在于定性或者定量的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系、轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系分別進(jìn)行5′-RACE，測(cè)出兩個(gè)品系外源基因片段和內(nèi)源基因重組的邊界序列，并按照邊界特異性序列設(shè)計(jì)出相應(yīng)的引物探針對(duì)，首次建立了轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系的實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR

2、檢測(cè)方法。轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系的熒光PCR檢測(cè)方法在模板DNA濃度為100 ng/反應(yīng)時(shí)，檢測(cè)低限均為0.01%的轉(zhuǎn)基因含量；建立的轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系數(shù)字PCR檢測(cè)方法絕對(duì)靈敏度能準(zhǔn)確定量到模板DNA濃度分別為0.01 ng/μL和0.001 ng/μL的轉(zhuǎn)基因樣品。數(shù)字PCR方法相比于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏準(zhǔn)確、可絕

3、對(duì)定量等特點(diǎn)，這對(duì)于轉(zhuǎn)基因品系的實(shí)際檢測(cè)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
　　阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）可導(dǎo)致免疫力低下的新生兒神經(jīng)系統(tǒng)紊亂如腦膜炎以及患菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，嬰幼兒配方奶粉是至今已知的最主要的感染途徑。而檢測(cè)阪崎腸桿菌的關(guān)鍵就在于實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR檢測(cè)方法。本研究首次建立了微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)阪崎腸桿菌的絕對(duì)定量檢測(cè)方法。根據(jù)阪崎腸桿菌的特異性基因序列，設(shè)計(jì)引物和熒光探針，并

4、進(jìn)行篩選，和其它12種近緣的、食品中常見(jiàn)的其它菌種一起進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針的特異性以及檢測(cè)低限實(shí)驗(yàn)，作為數(shù)字PCR的準(zhǔn)備與參照。以阪崎腸桿菌基因組DNA制備絕對(duì)靈敏度與相對(duì)靈敏度的梯度稀釋DNA進(jìn)行PCR的定量檢測(cè)，并確定和驗(yàn)證檢測(cè)體系的穩(wěn)定性、精密度、線性范圍及檢測(cè)低限等指標(biāo)。本研究建立的檢測(cè)阪崎腸桿菌的QX200數(shù)字PCR檢測(cè)方法定量檢測(cè)低限為5×10-5 ng/μL，達(dá)到實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)低限，同時(shí)在阪崎腸桿菌基因組濃

5、度等于5×10-6 ng/μL時(shí)，仍可以檢出病原菌，說(shuō)明QX200數(shù)字PCR檢測(cè)方法靈敏度達(dá)到甚至超過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法。樣品DNA模板濃度為5×10-3 ng/μL時(shí)，在阪崎腸桿菌基因組DNA相對(duì)含量區(qū)間為1.5625%-100%情況下具有較好的定量檢出阪崎腸桿菌的能力；在樣品模板濃度為5×10-3 ng/μL且阪崎腸桿菌在0.78125%-1.5625%時(shí)，也可以實(shí)現(xiàn)痕量阪崎腸桿菌樣品的檢出。首次建立的數(shù)字 PCR檢測(cè)方法具有較高的