水稻內標準基因的研究及利用TaqMan熒光定量PCR技術檢測轉基因水稻外源基因拷貝數.pdf

1、在轉基因植物檢測和基因拷貝數測定中往往需要使用內標準基因.Lectin和Zein基因已經被證實可用于轉基因大豆和玉米的檢測,但適于轉基因水稻外源基因檢測的內標準基因以及利用熒光定量PCR方法檢測外源基因拷貝數目前尚未見相關報道.本論文內容分為適合于轉基因水稻外源基因檢測的內標準基因的確定和利用TaqMan熒光定量PCR技術檢測轉基因水稻外源基因拷貝數兩部分.首先,通過生物信息學分析,選擇蔗糖磷酸化合成酶(sucrose phosphat

2、e synthase,SPS)基因作為候選的水稻內標準基因.利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 2.0軟件設計其特異性的引物和探針并建立相應的定性定量PCR反應體系.定性定量PCR反應結果表明在15個不同的水稻品種中均能擴增得到相同的SPS片段,而在其他常見植物例如向日葵、番茄、茄子、煙草、辣椒、劍麻、大豆、綠豆、大麥、小麥、玉米、油菜、擬南芥、楊梅和胡蘿卜中均未擴增得到相應的SPS片段.South

3、ern雜交結果表明該SPS在不同的水稻品種中均為單拷貝基因.研究結果表明該SPS基因具有種內非特異性、種間特異性以及單拷貝的特點,可以作為轉基因水稻中外源基因定性、定量PCR檢測及拷貝數分析的內標準基因.靈敏度分析結果表明本研究建立的SPS定性、定量PCR檢測方法可分別檢測到0.05ng(100拷貝)和0.005ng(10拷貝)的水稻基因組DNA,完全適合于對轉基因水稻進行定性和定量檢測.其次,在上述研究的基礎上,利用軟件設計了針對轉基

4、因水稻中外源β-半乳糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因和潮霉素磷酸轉移酶(hygromycin phosphortransferase,HPT)基因的定量PCR檢測引物和探針,并建立了相應的定量PCR反應體系.該定量體系的檢測靈敏度為10拷貝,與水稻內標準SPS基因定量PCR檢測靈敏度相近.利用本研究建立的SPS、GUS和HPT基因的定量PCR檢測體系,對26個同時含有GUS和HPT基因的轉基因水稻中外源基因GUS、