轉(zhuǎn)基因豬中外源基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)的研究.pdf

1、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物品種改良、生產(chǎn)珍貴蛋白、建立疾病模型、基因治療和器官移植等方面。近十年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)的結(jié)合使轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。目前人們已獲得小鼠、大鼠、豬、牛和羊等多種轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)室也于2006年獲得了我國首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬。確定外源基因的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)是后續(xù)對(duì)外源基因表型研究和功能探討的前提條件。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)主要研究了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬及其子代中外源基因拷貝數(shù)和整合位

2、點(diǎn)，并利用Junction-PCR 對(duì)整合位點(diǎn)進(jìn)行確定，同時(shí)進(jìn)一步分析了整合位點(diǎn)的純合性。
　　 本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果如下：
　　 1.首先采用了PCR 法對(duì)轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行初步鑒定，然后PCR 法檢測的陽性個(gè)體再經(jīng)Southern Blot 法做進(jìn)一步確定。本次實(shí)驗(yàn)兩種方法取得了一致的鑒定結(jié)果，共獲得兩只原代轉(zhuǎn)基因豬和七只F1 代陽性仔豬。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)以TFRC 基因?yàn)閮?nèi)參，采用絕對(duì)定量PCR 法檢測外源基因拷貝數(shù)

3、。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Log2N (拷貝數(shù)) = -0.9354 Ct+3.4116 (R △ 2=0.9974, p<0.001)，計(jì)算得到兩只原代轉(zhuǎn)基因豬外源基因拷貝數(shù)分別為30.489±1.7696 和18.8676±1.3383，七只陽性仔豬外源基因拷貝數(shù)分別為7.0141±0.3441、6.859±0.5157、9.8897±1.0931、9.1881±1.2008、3.6708±0.5886、5.7114±0.8494 和9.540

4、4±0.8438。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)采用TAIL-PCR 和LM-PCR 成功地克隆轉(zhuǎn)基因豬中外源基因整合位點(diǎn)，其中TAIL-PCR 得到25 條特異性條帶，而LM-PCR 得到12 條特異性條帶。
　　 4.將得到的序列經(jīng)BLAST 比對(duì)，共獲得TgInS1 (1440bp)、TgInS2 (1263bp)和TgInS3(1861bp)三個(gè)整合位點(diǎn)，其中TgInS1 為L1M LINE 序列，TgInS2 和TgInS

5、3 與豬ESTs 同源。
　　 5.采用整合位點(diǎn)側(cè)翼序列特異性引物與外源基因特異性引物的組合，進(jìn)行Junction PCR，得到預(yù)計(jì)大小的特異性片段，確定了整合位點(diǎn)克隆的準(zhǔn)確性。
　　 6.采用整合位點(diǎn)5’上游和3’下游側(cè)翼序列特異性引物與外源基因特異性引物的組合，進(jìn)行Junction PCR，分析整合位點(diǎn)的純合性。檢測的轉(zhuǎn)基因豬都得到與野生型豬一致的側(cè)翼序列特異性引物擴(kuò)增片段，表明我們獲得的轉(zhuǎn)基因豬都為整合位點(diǎn)雜合子。