Tβ4轉基因絨山羊中目的基因拷貝數(shù)及表達量與產絨性能關系的研究.pdf

1、21世紀以來，隨著基因工程、顯微注射、體細胞克隆、胚胎移植等相關技術的不斷完善，轉基因動物的生產得到了迅速的發(fā)展。2008年，我國啟動了轉基因動物新品種培育的重大專項，轉基因動物的生產與培育取得了顯著性的進展。目前，我國已經獲得了多種轉基因哺乳動物，本實驗室于2011年也獲得了我國首例胸腺素β4基因轉基因克隆絨山羊。研究表明:胸腺素β4的過表達可以促進毛囊的生長和發(fā)育，而外源基因的拷貝數(shù)和整合位點與外源基因的表達有著密切的聯(lián)系。因此，本

2、實驗選取產絨性能顯著改善的轉Tβ4基因絨山羊(NO.91和NO.28)和產絨性能未顯著改善的轉Tβ4基因絨山羊(NO.14和NO.94)，分析外源基因的拷貝數(shù)與表達量之間的關系;再通過與體細胞克隆絨山羊(NO.81)的比較，研究Tβ4基因表達量與產絨量之間的內在聯(lián)系，為轉基因絨山羊的檢測和轉基因新品種的培育提供可靠的技術方法和理論依據(jù)。
　　1)轉基因絨山羊的陽性檢測
　　本實驗首先采用Southern blot和PCR技術

3、同時篩選轉基因陽性絨山羊，然后再利用單一PCR技術對外源基因的多個位點進行鑒定。結果表明:四只轉基因絨山羊全部為陽性，并且外源基因的多個位點（KAP6.1、Tβ4、CMV啟動子、DsRed和新霉素抗性基因）都整合到轉基因絨山羊的基因組中。
　　2)外源基因拷貝數(shù)檢測
　　本實驗以glucagon作為內標準基因，利用實時熒光定量PCR技術檢測外源基因的拷貝數(shù)。絕對定量PCR的標準曲線為: log5N=-0.3794△ Ct+0

4、.8384（R2=0.9969)（△Ct為外源基因Ct與內標準基因Ct的差，N代表拷貝數(shù)），計算得到NO.28、NO.91、NO.14和NO.94原代轉基因絨山羊中外源基因的拷貝數(shù)分別為2、4、6和1。
　　3) Tβ4基因的相對表達量
　　選取GAPDH作為內參，利用實時定量熒光PCR技術檢測Tβ4基因mRNA的相對表達量，結果表明:內源基因GAPDH和目的基因Tβ4標準曲線的相關系數(shù)分別為0.999和0.997，擴增效率

5、為0.97和0.96;與體細胞克隆絨山羊NO.81相比，NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的mRNA的相對表達量分別為2.68、2.46、2.36和2.57倍;選取β-actin作為內參，利用western blot技術檢測Tβ4基因蛋白質的相對表達量。western blot結果顯示:與體細胞克隆絨山羊NO.81相比，NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的蛋白質相對表達量分別為1.384、1.380、1.166、

6、0.982倍。
　　4) Tβ4基因在毛囊中的表達量及絨毛比和產絨量分析
　　采用石蠟切片和免疫組化技術分析毛囊中Tβ4基因的表達量，結果顯示NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的毛囊中蛋白質的相對表達量是分別為體細胞克隆絨山羊NO.81的1.908、1.442、1.233、1.331倍。應用冰凍切片和HE染色來分析轉基因絨山羊皮膚中的絨毛比，結果表明: NO.28、NO.91、NO.14、NO.94和NO.81的