人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊中抗性基因刪除的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過遺傳工程手段對(duì)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行人為的改造,并使改造后的基因在世代間可以傳遞和表達(dá)的動(dòng)物.大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過程中不可避免的會(huì)使用來源于病毒或細(xì)菌的抗性基因,這些序列對(duì)目的基因的表達(dá)、受體動(dòng)物以及轉(zhuǎn)基因生物的安全等帶來復(fù)雜的負(fù)面影響.為消除這些不利因素,本文以整合有l(wèi)oxP-neo-tk-loxP框架(LNKL)的轉(zhuǎn)基因山羊耳成纖維細(xì)胞(Goat ear fibroblast,GEF)為研究對(duì)象,探索了通過Cr

2、e/loxP系統(tǒng)刪除抗性基因的可行性,建立一套安全、高效的刪除轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)外源冗余序列的技術(shù)體系. 首先,我們分離了乳汁內(nèi)表達(dá)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊GEF(GEF-BLG-1和GEF-BLG-2),細(xì)胞大小、形態(tài)等未發(fā)現(xiàn)異常,抗性基因保留完整.通過電轉(zhuǎn)和脂質(zhì)體兩種轉(zhuǎn)染方法發(fā)現(xiàn),pBSl85質(zhì)粒在GEF內(nèi)的瞬間表達(dá)Cre重組酶能夠引發(fā)LNKL的刪除,但效率僅為O.8﹪,在挑取的515個(gè)克隆中,最后經(jīng)PCR鑒定為抗性基因刪除的細(xì)胞克

3、隆只有4個(gè).更重要的是所挑克隆,細(xì)胞老化嚴(yán)重,無法用于后續(xù)核移植以制備轉(zhuǎn)基因山羊. 隨后,本文探索了通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre重組酶的方法刪除抗性基因的可能性.包含有pET-cre質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DES),經(jīng)O.1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)3h后,表達(dá)了CRET<'TAT>,最高約占菌體總蛋白的48.6﹪.根據(jù)Cre重組酶的PI值約為10.3的特性,我們通過SP sepharose<'TM>和Sotlrce 15s兩步陽離子交換

4、色譜純化出CRE<'TAT>, SDS-PAGE為單一條帶.純化的CRE<'TAT>經(jīng)進(jìn)一步緩沖液替換后進(jìn)行體外活性測(cè)定,結(jié)果表明該蛋白能夠有效將線形的pLNKL內(nèi)的同向loxP位點(diǎn)間隔的序列切除. 將純化的CRE<'TAT>與GEF-BLG-2體外共同孵育,以介導(dǎo)GEF-BLG-2內(nèi)DNA重組,刪除LNKL序列.2μM CRE<'TAT>處理細(xì)胞,通過培養(yǎng),挑克隆,G418敏感性實(shí)驗(yàn),PCR鑒定以及Southern_blot鑒

5、定,最終獲得抗性基因刪除的且保留了人溶菌酶基因表達(dá)框架的單細(xì)胞克隆.抗性基因刪除效率為42﹪.另外,所得細(xì)胞克隆在增殖速度、形態(tài)、大小等方面,均與未處理細(xì)胞無明顯差異.最后,為評(píng)估CRE<'TAJ> 的處理是否會(huì)影響體細(xì)胞克隆重構(gòu)胚的發(fā)育潛能,我們將所得細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究.研究發(fā)現(xiàn),在融合率(O.88)、回收包埋卵率(O.78)以及囊胚發(fā)育率(0.30)等方面,CRE<'TAJ>處理過的細(xì)胞均不低于未處理組(分別為O.64,O.5