轉人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎兒成纖維細胞株的建立及轉基因奶山羊的鑒定.pdf

1、α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-LA）是乳清蛋白中主要的鈣結合蛋白，同時還是乳糖合成酶的一個亞基，控制著乳糖的合成。α-LA能提高機體免疫力，有較高的營養(yǎng)價值，在人乳中含量約為2.9mg/mL，但在羊乳中含量較低，因此通過轉基因的方法提高羊乳中α-LA的水平，可提高羊乳的價值。本研究應用基因克隆、細胞培養(yǎng)、脂質體轉染、PCR和Western-blot等技術建立了轉α-LA基因的奶山羊胎兒成纖維細胞株（Goat fe

2、tal fibroblast cells，gFFCs），為制備轉基因克隆奶山羊提供了供核細胞;同時應用TAIL-PCR、RT-PCR和Western-blot技術對本實驗室制備的轉人α-LA基因奶山羊進行了鑒定。
　　(1)含調控序列的人α-LA全基因克隆及其表達載體構建。
　　以人基因組為模板，擴增含5'調控區(qū)和部分3'調控區(qū)的人α-LA全基因序列，將其克隆到pMD19-T載體上，構建克隆載體PLAT;酶切質粒B9獲得載體

3、片段NI3A（含Neo-IRES-EGFP共表達序列作為篩選標記基因，1.7kb3'βLG作為3'調控序列），酶切PLAT獲得PLA，將二者連接得到乳腺特異性表達載體PLAN，經酶切及測序鑒定均正確。采用脂質體轉染法將PLAN瞬時轉染至奶山羊胎兒成纖維細胞，轉染細胞有綠色熒光蛋白表達。
　　(2)真核表達載體PLAN在山羊乳腺上皮細胞中的誘導表達及人α-LA檢測。
　　采用脂質體Lipofectamin TM LTX Rea

4、gent+PLUSTM Reagent介導轉染法，以本實驗室保存的轉基因載體5A和NI3A為對照，將表達載體PLAN轉染進山羊乳腺上皮細胞。經含胰島素（10μg/mL）、催乳素(5μg/mL)及氫化可的松（10μg/mL）的DMED/F12培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)，分別在轉染24h、48h和72h收集上清液，Western blot檢測其α-LA的表達情況。結果顯示誘導培養(yǎng)液中有目的蛋白表達，分子量約為14kD，表明本實驗所構建的轉基因載體能夠在

5、山羊乳腺細胞誘導表達α-LA，為后續(xù)乳腺生物反應器的研究奠定了基礎。
　　(3)整合含調控序列人α-LA基因奶山羊胎兒成纖維細胞株的篩選。
　　采用脂質體Lipofectamin TM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介導轉染法，將線性化的PLAN轉進奶山羊胎兒成纖維細胞中。用1000μg/mL G418抗性篩選1周，500μg/mL G418篩選2周，結合EGFP挑選出綠色熒光克隆擴大培養(yǎng);經巢式PCR

6、擴增鑒定，篩選得到的細胞株均已成功整合目的基因。結果表明，本實驗得到的轉基因細胞株可以為制作轉基因克隆奶山羊提供供核細胞。
　　(4)轉人α-LA基因奶山羊的鑒定。
　　用TAIL-PCR的方法獲得轉基因插入序列5'端和3'端已知序列鄰近的未知序列;用RT-PCR和Western-blot檢測乳腺上皮細胞中mRNA和羊乳中α-LA的表達情況。切膠回收TAIL-PCR產物，將測序結果與已知序列和奶山羊基因組序列比對，結果顯示外