同源重組敲除β-lactoglobulin基因的山羊耳組織成纖維細胞的構建.pdf

1、基因敲除技術是利用同源重組,對基因組進行定點精確遺傳修飾的一種方法。利用動物轉基因技術和動物克隆技術,再結合基因打靶技術,人們開展了基因的定點修復、遺傳缺陷的治療、動物不利基因的敲除失活等一系列的動物基因組修飾的理論和應用研究。這些技術也為動物乳腺反應器研究和提高表達率提供了重要幫助,為實現(xiàn)基因定點整合及乳腺特異性表達尋找到途徑,無疑成為當今動物遺傳學研究的熱門和重點。
　　 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin。BLG

2、)是嬰兒乳過敏癥的主要的過敏原之一。為了提高乳品質量,消除乳汁中BLG過敏原顯得尤為重要。雖然當前有針對降低BLG過敏癥的一些方法,但不能從根本上消除乳汁中的BLG,也就無法徹底地解決BLG的致敏性問題。本研究對山羊體細胞β-lactoglobulin基因敲除進行了初步探索,研究的目的在于利用山羊BLG基因打靶載體,對山羊耳組織成纖維細胞進行定點基因敲除,然后經(jīng)過脂質體轉染和藥物正負篩選技術,構建敲除BLG基因的山羊耳組織成纖維細胞,為

3、生產(chǎn)乳汁中不含BLG的山羊新品種奠定基礎。
　　 本研究共分兩部分,第一,利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)山羊耳組織成纖維細胞;第二,利用構建的打靶載體,構建敲除β-lactoglobulin基因的成纖維細胞。主要進行了:(1)利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)山羊耳組織成纖維細胞,并進行了細胞凍存復蘇,測定了細胞活率和生長曲線:(2)利用脂質體法將打靶載體pBLG2T載體轉染入山羊耳組織成纖維細胞;(3)用G418和丙氧鳥苷對轉染后的成纖維細胞

4、進行了共計17d的正負藥物篩選;(4)PCR鑒定篩選得到的細胞克隆;(5)比較陽性細胞和普通細胞的活力區(qū)別,并對陽性細胞克隆進行核型分析。研究結果如下:
　　 1.成功分離培養(yǎng)了山羊耳組織成纖維細胞。凍存前細胞存活率為97.0%,經(jīng)凍存復蘇后的細胞存活率為92.3%。細胞的生長曲線里“S”型,依次經(jīng)歷了潛伏生長期、對數(shù)生長期和平臺期。
　　 2.根據(jù)山羊耳組織成纖維細胞對G418的耐受分析結果和細胞生長狀況,選擇G418

5、濃度400μg/mL為初篩濃度,200μg/mL為維持濃度,對細胞進行了7d的正篩選,然后用G418和GANC進行了10d的負篩選,得到了12個細胞克隆。
　　 3.PCR法檢測,結果顯示只有1號細胞克隆有neo基因條帶,并出現(xiàn)了預期的打靶條帶,初步認為該克隆發(fā)生了預期的同源重組。該陽性細胞克隆細胞核型穩(wěn)定,可以作為供體細胞。細胞活力顯著低于普通成纖維細胞的細胞活力(1.556±0.026vs1.726±0.036.P＜0.01