人牙齦成纖維細胞構建組織工程化血管的實驗研究.pdf

1、第一部分人牙齦成纖維細胞誘導分化為血管內皮細胞的研究
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）誘導分化為血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）。探討人牙齦成纖維細胞（HGFs）在體外分化為血管內皮細胞（VEC）的潛能。
　　方法：
　　1牙齦組織的獲取和分離
　　正常人牙齦組織取自河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口

2、腔頜面外科，患者下頜阻生齒拔除術。牙齦組織手術切取后帶回實驗室，在無菌條件下分離牙齦上皮及結締組織，留取牙齦結締組織進行細胞培養(yǎng)。
　　2人牙齦成纖維細胞（HGFs）的培養(yǎng)
　　培養(yǎng)液選用含15％胎牛血清的L-DMEM。牙齦結締組織剪成1 mm×1 mm的組織塊，進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞達到80%融合后，進行細胞傳代培養(yǎng)。
　　3人牙齦成纖維細胞（HGFs）的鑒定
　　3.1流式細胞儀檢測人牙齦成纖維細胞（ HG

3、Fs），選擇波形蛋白（vimentin）抗體和CD31抗體鑒定成纖維細胞和血管內皮細胞。
　　3.2人牙齦成纖維細胞（HGFs）的RT-PCR鑒定
　　TRIzol法提取成纖維細胞的總RNA；
　　以分光光度計測定細胞總 RNA的純度及濃度；
　　應用反轉錄試劑盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA；
　　以適量反轉錄所得的cDNA為模版，在

4、TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增；
　　將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后置于凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，以GAPDH作為內參照校正，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。
　　3.3人牙齦成纖維細胞（HGFs）免疫細胞化學染色
　　采用鼠抗人vimentin單克隆抗體、鼠抗人III型膠原單克隆抗體，通過免疫細胞化學染色法檢測vimentin蛋白和III型膠原蛋白在人

5、牙齦成纖維細胞中的表達與分布。
　　3.4人牙齦成纖維細胞（HGFs）免疫熒光染色
　　采用兔抗人S-100A4抗體和鼠抗人肌動蛋白α（α-SMA）抗體，通過免疫熒光染色法檢測 S-100A4蛋白和α-SMA蛋白在人牙齦成纖維細胞HGFs中的表達與分布。
　　4生長曲線的測定
　　采用MTT法測定第1~6代人牙齦成纖維細胞（HGFs）1~7天的OD490 nm處的吸光值。
　　5內皮細胞相關標記物在分化中的

6、人牙齦成纖維細胞（HGFs）中的表達
　　采用vimentin，血管生成素受體2（tie2）抗體和血管生長因子受體2（VEGFR2）抗體，通過Western blot半定量vimentin蛋白，tie2蛋白和VEGFR2蛋白在不同VEGF165濃度組和不同誘導周期組中的表達量。
　　Real-time PCR相對定量法檢測不同VEGF165濃度組和不同誘導周期組中vimentin基因，tie2基因，血管生成素2（Ang2）基

7、因的mRNA相對表達量。
　　6誘導過程中的形態(tài)學觀察
　　倒置顯微鏡觀察8 ng/ml VEGF165誘導人牙齦成纖維細胞（HGFs）0，7，14，21，28，35，42和50天時的形態(tài)學變化。
　　7誘導后血管內皮樣細胞的鑒定
　　7.1免疫細胞化學染色
　　8ng/ml VEGF165誘導人牙齦成纖維細胞35天后，采用鼠抗人 CD34單克隆抗體、鼠抗人 CD31單克隆抗體，通過免疫細胞化學染色法檢測C

8、D34蛋白和CD31蛋白在誘導后血管內皮樣細胞的表達與分布。
　　7.2免疫熒光染色
　　8ng/ml VEGF165誘導人牙齦成纖維細胞35天后，采用血管性假血友病因子（vWF）抗體和上皮鈣粘附分子（E-cadherin）抗體，通過免疫熒光染色檢測vWF蛋白和E-cadherin蛋白在誘導后血管內皮樣細胞的表達與分布。
　　7.3 RT-PCR鑒定誘導后血管內皮樣細胞中tie2基因的mRNA相對表達量。
　　7

9、.4經8 ng/ml VEGF誘導35天后，通過透射電鏡觀察誘導后血管內皮樣細胞的超微結構。
　　8流式細胞儀測定誘導細胞轉化率
　　采用CD34抗體和CD31抗體，通過流式細胞儀檢測誘導后血管內皮細胞中CD34和CD31的陽性表達率，以評估人牙齦成纖維細胞（HGFs）分化為血管內皮細胞（VEC）的轉化率。
　　9成管能力測試檢測誘導后血管內皮細胞的功能
　　將誘導前后細胞接種于24孔板的Matrigel基質膠中

10、，Olympus IX71倒置顯微鏡下觀察管狀排列結構和完整度并計數管狀結構的數量，對誘導后血管內皮細胞（VEC）的功能進行評估。
　　結果：
　　1人牙齦成纖維細胞（HGFs）的基本生長情況
　　細胞多數呈長梭形，細胞核較大，呈圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)以組織塊為中心向周圍輻射生長，傳代培養(yǎng)的細胞生長狀態(tài)好，3~4天即可生長達90%~100%。
　　2人牙齦成纖維細胞（HGFs）的鑒定結果
　　2.1流式細胞

11、儀檢測人牙齦成纖維細胞（HGFs）表面抗原vimentin和CD31表達結果
　　培養(yǎng)的成纖維樣細胞表面抗原 vimentin表達陽性，陽性率為（97.13±0.62）%；而表面抗原 CD31表達率僅為（8.64±1.55）%。兩者比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　2.2細胞RT-PCR鑒定結果
　　細胞 RT-PCR結果顯示人牙齦成纖維細胞（ HGFs）特異性表達vimentin，S-100A4和α-SMA。然

12、而，tie2在細胞中不表達。
　　2.3細胞的免疫細胞化學鑒定結果
　　鼠抗人vimentin單克隆抗體和鼠抗人III型膠原單克隆抗體染色結果顯示細胞呈陽性反應。
　　2.4細胞的免疫熒光染色鑒定結果
　　兔抗人S-100A4多克隆抗體和鼠抗人α-SMA單克隆抗體熒光染色結果顯示細胞分別呈綠色熒光和紅色熒光表達。
　　3人牙齦成纖維細胞（HGFs）生長曲線測定結果
　　結果顯示第2代或第3代人牙齦成纖

13、維細胞（HGFs）的對數生長期比其余代次細胞增殖水平顯著升高（P<0.05），而第2代或第3代細胞的對數生長期細胞增殖水平無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　4內皮細胞相關標記物在分化中的人牙齦成纖維細胞（HGFs）中的表達
　　Western blot結果顯示，8 ng/ml VEGF165誘導時tie2蛋白和VEGFR2的相對表達量最高。Real-time PCR結果顯示，經8 ng/ml VEGF165誘導時tie2基

14、因和Ang2基因的mRNA相對表達量達到最高。Western blot結果顯示，誘導周期達到35天時tie2蛋白和VEGFR2蛋白的相對表達含量最高。Real-time PCR結果顯示，誘導周期達到35天時tie2和Ang2基因的mRNA相對表達量最高。
　　5 VEGF165對誘導后細胞形態(tài)學的影響
　　人牙齦成纖維細胞（HGFs）經8 ng/ml VEGF165誘導7~14天，大部分細胞仍然呈現(xiàn)叢狀或束狀排列；14~21

15、天時，細胞逐漸排列形成多邊形上皮細胞樣結構；21~28天時，細胞逐漸出現(xiàn)融合成簇現(xiàn)象，逐漸形成鵝卵石樣或鋪路石樣的生長排列形式；28~35天時，絕大多數細胞呈現(xiàn)鋪路石樣的生長形式以及形成血管腔樣結構。
　　6免疫細胞化學染色對誘導后細胞的鑒定
　　鼠抗人CD34單克隆抗體和鼠抗人CD31單克隆抗體染色結果顯示細胞呈陽性反應。
　　7 RT-PCR鑒定誘導后細胞tie2基因的表達
　　RT-PCR結果顯示，與對照組

16、相比，tie2基因在誘導后細胞中顯著表達。
　　8免疫熒光染色對誘導后細胞的鑒定
　　兔抗人 vWF抗體和兔抗人 E-cadherin抗體熒光染色結果顯示細胞分別呈紅色熒光表達。
　　9誘導后細胞超微結構的觀察
　　透射電鏡觀察顯示，細胞表面呈現(xiàn)微絨毛結構，細胞胞漿內出現(xiàn)溶酶體結構及內皮細胞特有的Weibel-Palad小體（W-P小體）。
　　10流式細胞儀檢測分析人牙齦成纖維細胞（HGFs）向血管內皮細

17、胞（VEC）分化的轉分化率
　　誘導后細胞組CD34和CD31細胞表型陽性率與對照組相比，差異有顯著性，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　11成管能力測試實驗比較誘導前后細胞形成小管的能力
　　誘導形成的細胞組在Matrigel基質膠中24小時呈現(xiàn)管狀樣結構，與對照組相比，誘導組成管數目顯著增高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　第二部分人牙齦成纖維細胞誘導分化為血管平滑肌細胞的研究
　　目的：

18、r>　　體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）并誘導分化為血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），證實人牙齦成纖維細胞（ HGFs）具有在體外分化為血管平滑肌細胞（VSMC）的潛能。
　　方法：
　　1人牙齦組織的獲取，分離和細胞的培養(yǎng)同第一部分。
　　2人牙齦成纖維細胞（HGFs）的鑒定
　　2.1人牙齦成纖維細

19、胞（HGFs）的RT-PCR鑒定同第一部分。
　　2.2人牙齦成纖維細胞（HGFs）免疫細胞化學染色同第一部分。
　　2.3人牙齦成纖維細胞（HGFs）免疫熒光染色同第一部分。
　　3生長曲線的測定同第一部分。
　　4平滑肌細胞相關標記物在誘導分化中的人牙齦成纖維細胞（HGFs）中的表達
　　采用波形蛋白（ vimentin），肌動蛋白α（α-SMA）和肌球蛋白（SM-MHC）抗體，通過Western bl

20、ot半定量vimentin蛋白，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在不同PDGF-BB濃度組和不同誘導周期組中的表達量。
　　Real-time PCR相對定量法檢測不同PDGF-BB濃度組和不同誘導周期組中vimentin基因，α-SMA基因，SM-MHC基因，Calponin1（Cnn1）基因和平滑肌22α（SM22α）基因的mRNA相對表達量。
　　5誘導過程中細胞的形態(tài)學觀察
　　倒置顯微鏡觀察10 ng/ml

21、PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導人牙齦成纖維細胞（HGFs）0，7，14，21，28和35天時的形態(tài)學變化。
　　6誘導后細胞的鑒定
　　6.110 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導人牙齦成纖維細胞（HGFs）28天后，采用兔抗人α-SMA抗體和鼠抗人SM-MHC抗體，通過免疫細胞化學染色法檢測α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在誘導后血管平滑肌樣細胞的表達與分布。
　

22、　6.2采用Cnn1抗體和SM22α抗體，通過免疫熒光染色檢測Cnn1蛋白和SM22α蛋白在誘導后血管平滑肌樣細胞的表達與分布。
　　6.3 RT-PCR鑒定誘導后細胞中α-SMA基因和SM-MHC基因的表達量。
　　6.4經10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導人牙齦成纖維細胞（HGFs）28天后，通過透射電鏡觀察誘導后細胞的超微結構。
　　結果：
　　1人牙齦成纖維細胞（HGF

23、s）的基本生長情況:結果同第一部分。
　　2人牙齦成纖維細胞（HGFs）的鑒定
　　2.1細胞RT-PCR的鑒定
　　細胞特異性表達vimentin基因和S-100A4基因，弱表達α-SMA基因，不表達SM-MHC基因。
　　2.2細胞的免疫細胞化學鑒定:結果同第一部分。
　　2.3細胞的免疫熒光染色鑒定:結果同第一部分。
　　3人牙齦成纖維細胞（HGFs）生長曲線的測定結果:結果同第一部分。

24、　　4平滑肌細胞相關標記物在分化中的人牙齦成纖維細胞（HGFs）中的表達
　　Western blot結果顯示，誘導濃度達到10 ng/ml PDGF-BB時，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白的相對表達量最大；誘導周期達到28天時，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白的相對表達含量最高。
　　Real-time PCR結果顯示，當經10 ng/ml PDGF-BB誘導時α-SMA基因，SM-MHC基因，Cnn1基因和SM22α基

25、因的mRNA相對表達量最高；誘導周期達到28天時，α-SMA基因，SM-MHC基因，Cnn1基因，SM22α基因的mRNA相對表達量最高。
　　5誘導過程中細胞的形態(tài)學觀察
　　人牙齦成纖維細胞（ HGFs）經10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導0~7天，大部分細胞仍然呈現(xiàn)叢狀；7~21天時，部分細胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，細胞數量呈現(xiàn)一段時間的減少狀態(tài)，但仍然為叢狀排列；21~28天時，細胞伸出偽足

26、并相互連接，在密集與稀疏處相互交錯略呈“峰谷”狀，可與成纖維細胞相鑒別；28~35天，絕大多數細胞已呈典型的“峰谷”狀生長排列方式。
　　6免疫細胞化學染色對誘導后細胞的鑒定
　　結果顯示，誘導后細胞兔抗人α-SMA抗體呈強陽性反應，鼠抗人SM-MHC抗體呈陽性反應。對照組α-SMA仍呈陽性反應，SM-MHC單克隆抗體呈陰性反應。
　　7免疫熒光染色對誘導后細胞的鑒定
　　結果顯示，誘導后細胞SM22α抗體和Cn

27、n1抗體分別經Rhodamine和FITC熒光染色呈陽性反應，胞漿分別呈紅色熒光和綠色熒光表達。
　　8細胞RT-PCR檢測誘導后細胞α-SMA和SM-MHC基因的表達
　　誘導組α-SMA基因mRNA的相對含量明顯高于未誘導組，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；誘導組SM-MHC基因mRNA的相對含量明顯高于未誘導組，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　9誘導后細胞超微結構觀察結果
　　透射電鏡觀察可見胞漿中有

28、少量高爾基復合體，線粒體，粗面內質網，大量粗細不一的肌絲樣結構或肌絲束以及電子密度較高的密體樣結構等。
　　第三部分兔脫細胞血管基質聯(lián)合類人Ι型膠原合成支架材料的生物學特性及其細胞相容性的研究
　　目的：
　　應用凍干技術將類人 I型膠原蛋白（Human-like collagen I，HLC-I）合成高分子材料與兔脫細胞血管基質（acellular vascular matrix，ACVM）支架材料復合，制備ACVM

29、-0.25%HLC-I血管支架材料，探討其生物學特性及與細胞的相容性。
　　方法：
　　1 ACVM基質的制備
　　稱量家兔體重，注射麻醉并結扎預取動脈分支，迅速切取血管，浸入生理鹽水中，沖洗管腔后浸入含有1%苯扎溴銨的PBS復合液中60分鐘，沖洗后0.1%胰蛋白酶處理6小時，沖洗后移入1% TritonX-100中72小時，制備的ACVM基質浸入PBS中保存于4?C冰箱。
　　2 ACVM基質HE染色，觀察脫細

30、胞情況。
　　3 ACVM基質Masson染色，觀察脫細胞情況及ACVM基質中的膠原成分。
　　4 ACVM與HLC-I的復合
　　丙烯酸預處理 ACVM基質，紫外燈輻射30分鐘，蒸餾水洗凈數次后放入真空干燥器中；預處理 ACVM浸入到碳化二亞胺水溶性中，4oC冰箱中1小時；將不同濃度 HLC-I（0.10 mg/ml，0.25 mg/ml，0.50 mg/ml，0.75 mg/ml，1.00 mg/ml）復合于 AC

31、VM基質表面12小時；清洗后ACVM-HLC-I支架減壓干燥，4 oC保存?zhèn)溆谩?br>　　5人牙齦成纖維細胞（HGFs）的培養(yǎng)擴增及鑒定，實驗方法同第一部分。
　　6 MTT法測定 HLC-I與 ACVM的交聯(lián)的最佳濃度
　　在不同濃度 ACVM-HLC-I支架上接種人牙齦成纖維細胞（HGFs），分別培養(yǎng)1，4，7天時測量各孔 OD490 nm的吸光值，以確定 HLC-I與ACVM基質交聯(lián)的最佳濃度。
　　7支架的吸

32、水性測試
　　實驗分為兩組，ACVM-0.25% HLC-I支架組和 ACVM支架組，室溫條件下，分別稱量兩組材料浸入 PBS前后的重量，干燥狀態(tài)下重量標記為 W0，浸濕24小時后重量標記為 W1。支架材料的吸水量百分比計算公式：W1-W0／W0×100%。
　　8支架的力學性能測定
　　采用 Zwick/Roell Z020型萬能力學實驗機來檢測標本的拉伸強度，斷裂強度和斷裂伸長率。實驗分為未脫細胞的兔血管組，單純

33、ACVM支架組和 ACVM-0.25%HLC-I支架組進行檢測，記錄應力和應變，繪制出應力-應變曲線。
　　9支架的壓力爆破實驗
　　實驗分為未脫細胞的兔血管組，單純ACVM支架組和ACVM-0.25%HLC-I支架組。用注滿生理鹽水的壓力槍進行壓力爆破實驗。
　　10掃描電鏡觀察支架表面結構
　　A組為未脫細胞的血管組織；B組為 ACVM支架；C組為ACVM-0.25%HLC-I支架，分別觀察支架的側面和內面。

34、
　　11 CCK-8試劑盒檢測 ACVM-0.25%HLC-I支架的體外細胞毒性
　　待測樣品分為 ACVM-0.25%HLC-I支架組和單純 ACVM支架組，鋪于96孔板中，與100μl細胞懸液培養(yǎng)24，48和72小時，用 CCK-8試劑盒進行檢測，酶標儀測定各組在450 nm處的吸光度，通過計算細胞毒性活力（%），即相對生長率來評價支架的體外細胞毒性。
　　結果：
　　1 ACVM基質大體觀察結果
　

35、　ACVM基質呈乳白色，管腔塌陷，管壁變薄，彈性消失并可折疊。
　　2 HE染色觀察ACVM基質脫細胞程度
　　結果顯示，內膜層呈現(xiàn)透明狀，無藍染細胞核及細胞碎片等殘留物，中膜層已經無平滑肌細胞結構，未見藍染細胞核及細胞碎片等物質，整個管壁變薄，纖維結構稀疏。
　　3 Masson染色觀察ACVM基質膠原成分及脫細胞程度
　　結果顯示，ACVM基質中血管內皮細胞，血管平滑肌細胞和大部分肌纖維等成分脫落，大部分為染

36、成綠色的膠原纖維和少量染成紅色的肌纖維，但纖維結構稀疏。
　　4人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）的培養(yǎng)、傳代及鑒定結果
　　結果同第一部分。
　　5 MTT法測定HLC-I與ACVM支架的最佳復合濃度
　　細胞接種于不同濃度HLC-I復合的ACVM支架后經1，4和7天培養(yǎng)后，MTT實驗結果顯示，0.25%HLC-I復合于ACVM支架上更有利于細胞的增殖，即為ACV

37、M-0.25%HLC-I支架。
　　6 ACVM-0.25%HLC-I的吸水性測試結果
　　結果顯示，ACVM-0.25%HLC-I支架與ACVM支架相比，吸水能力無差別，二者無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　7 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的生物力學測定結果
　　ACVM-0.25% HLC-I支架的應力和應變均大于 ACVM支架，而與未脫細胞兔血管無統(tǒng)計學差異。ACVM-0.25% HLC-I支架

38、的抗拉伸能力與未處理的天然兔血管更加接近，而 ACVM支架的抗拉伸能力最差。ACVM-0.25% HLC-I支架的斷裂強度和斷裂伸長率均與未處理的天然兔血管相近，而 ACVM支架斷裂強度與未處理的天然兔血管相比有所降低，其斷裂伸長率卻有所增加。
　　8 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的壓力爆破實驗結果
　　ACVM-0.25% HLC-I支架的爆破壓力大于單純 ACVM基質的爆破壓力（P<0.05）；而 ACVM-0

39、.25% HLC-I支架與未經脫細胞處理兔血管的爆破壓力無差別（P>0.05）。
　　9掃描電鏡觀察ACVM-0.25%HLC-I支架表面結構的超微結構
　　經0.25%的HLC-I復合后，掃描電鏡可見ACVM-0.25% HLC-I支架與ACVM基質相比，纖維更加致密，內膜層，中膜層和外膜層分界不清，各層均未見細胞分布。
　　10 ACVM-0.25%HLC-I支架的體外細胞毒性測試結果
　　ACVM-0.25

40、% HLC-I支架和 ACVM支架的相對生長率（RGR）在24，48和72小時時各時間點均在75%以上，ACVM-0.25%HLC-I支架和 ACVM支架的體外細胞毒性評估均合格。隨著時間的增加（24，48和72小時），細胞在兩種支架材料上的增殖情況為逐漸上升的趨勢。
　　第四部分體外構建組織工程化血管及裸鼠體內動態(tài)強化的研究
　　目的：
　　采用分層方式將人牙齦成纖維細胞（human gingival fibrobl

41、asts，HGFs）誘導分化形成的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）種植于 ACVM-0.25%HLC-I支架上構建初級組織工程化血管，再將初級組織工程化血管埋植于裸鼠皮下進行動物體內動態(tài)強化實驗，探討人牙齦成纖維細胞（HGFs）聯(lián)合 ACVM-0.25%HLC-I支架構建組織工程化血管的可行性及裸鼠體內作用力對構

42、建的組織工程化血管的影響。
　　方法：
　　1 ACVM-0.25% HLC-I支架材料的制備與處理，實驗方法同第三部分。
　　2 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的消毒處理
　　3 EdU Apollo488標記誘導形成的血管平滑肌細胞（VSMC）和血管內皮細胞（VEC）及鑒定標記率
　　4 EdU Apollo488標記血管平滑肌細胞（ VSMC）并種植于ACVM-0.25%HLC-I支架

43、　　采用多次沉淀法將 EdU Apollo488標記的誘導血管平滑肌細胞（VSMC）（1×106/ml）種植于ACVM-0.25% HLC-I支架上，連續(xù)培養(yǎng)7天。
　　5 DAPI標記誘導形成的血管內皮細胞（VEC）及熒光顯微鏡下觀察標記率
　　6凝膠法種植誘導的血管內皮細胞（VEC）
　　將DAPI標記的血管內皮細胞（VEC）與Matrigel基質按照4:1的比例混合制備成 VECs-Matrigel凝膠，均勻涂抹

44、于種植有VSMCs-ACVM-0.25% HLC-I支架材料的表面，置于37?C，5% CO2的培養(yǎng)箱內，12小時后加入含15%FBS的1640:L-DMEM＝1:1的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)3天。
　　7種子細胞種植支架后HE染色觀察
　　8種子細胞種植支架后免疫組化染色
　　兔抗人肌動蛋白（α-SMA）抗體或鼠抗人肌球蛋白（SM-MHC）抗體特異性標記ACVM-0.25%HLC-I支架上的血管平滑肌細胞（VSMC）。鼠抗人

45、CD34抗體和鼠抗人CD31抗體特異性標記ACVM-0.25% HLC-I支架表面生長的血管內皮細胞（VEC）。
　　9種子細胞種植支架后免疫熒光染色
　　9.1免疫熒光單標鑒定
　　Calponin1（Cnn1）蛋白和平滑肌22α（SM22α）蛋白特異性標記ACVM-0.25% HLC-I支架表面及內部生長的血管平滑肌細胞（VSMC），熒光二抗采用 FITC；血管性假血友病因子（vWF）蛋白和上皮鈣粘附分子（E-ca

46、dherin）蛋白特異性標記ACVM-0.25%HLC-I支架表面生長的血管內皮細胞（VEC），熒光二抗采用Rhodamine，激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。
　　9.2免疫熒光雙標鑒定
　　一抗采用兔抗人SM22α抗體和鼠抗人vWF抗體或鼠抗人Cnn1抗體和兔抗人 E-cadherin抗體；一抗采用兔抗人α-SMA抗體和鼠抗人CD34抗體或鼠抗人SM-MHC抗體和兔抗人CD31抗體；熒光二抗采用山羊抗鼠 Rhodamine

47、和山羊抗兔 FITC或山羊抗兔 Rodamine和山羊抗鼠 FITC進行免疫熒光雙標。同時標記ACVM-0.25%HLC-I支架上的兩種細胞。
　　10掃描電鏡觀察
　　11裸鼠體內動態(tài)強化實驗
　　將單純ACVM-0.25% HLC-I支架組和構建的血管組植入裸鼠皮下。分別于術后第3、6、9周再次麻醉動物，取出植入皮下的組織進行固定，行組織學觀察，熒光染色觀察和壓力承受實驗測定。
　　11.1組織學觀察

48、　　11.2 EdU Apollo488和DAPI熒光染色示蹤細胞
　　11.3壓力承受實驗測定
　　實驗分為裸鼠體內埋植的單純ACVM-0.25%HLC-I支架組，構建的血管組和正常血管組，用注滿生理鹽水的壓力槍進行壓力爆破實驗。
　　結果：
　　1細胞示蹤標記率結果
　　EdU Apollo488標記的誘導血管平滑肌細胞（VSMC）和血管內皮細胞（VEC）在熒光顯微鏡下可見90%以上的細胞被標記上；經D

49、API標記的誘導血管內皮細胞（VEC）在熒光顯微鏡下可見90%以上的細胞被標記上。
　　2體外構建組織工程化血管
　　2.1 HE染色觀察
　　單獨種植誘導的血管平滑肌細胞（VSMC）于ACVM-0.25%HLC-I支架時，可見細胞在支架材料內部及表面均勻生長；單獨種植誘導的血管內皮細胞（VEC）于 Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架表面時，細胞單層排列分布于支架表面；種植兩種細胞于ACVM-0.2

50、5% HLC-I支架時可見內層為誘導血管內皮細胞（VEC）層，中間為Matrigel-VSMCs層，最外層為纖維支架層。
　　2.2免疫組化染色結果
　　單獨種植誘導的血管平滑肌細胞（VSMC）于ACVM-0.25%HLC-I支架時，細胞呈α-SMA和SM-MHC抗原陽性反應。單獨種植誘導的血管內皮細胞（VEC）于 Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架時，細胞呈 CD34和CD31抗原陽性反應。
　　

51、2.3免疫熒光染色結果
　　2.3.1免疫熒光單標結果
　　單獨種植誘導的血管平滑肌細胞（VSMC）于 ACVM-0.25% HLC-I支架時，Cnn1和SM22α抗原陽性反應，支架內部和表面的細胞被FITC染成綠色熒光，細胞核被DAPI染成藍色。單獨種植誘導的血管內皮細胞（VEC）于Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架時，vWF和E-cadherin抗原陽性反應，支架表面的細胞被Rhodamine染成紅色

52、熒光，細胞核被DAPI染成藍色。
　　2.3.2免疫熒光雙標結果
　　分層種植于ACVM-0.25%HLC-I支架的種子細胞中，支架材料內部的細胞SM22α，Cnn1，α-SMA或SM-MHC抗原陽性反應，胞漿FITC呈綠色熒光表達，表面的部分細胞 vWF，E-cadherin，CD34或 CD31抗原陽性反應，胞漿Rhodamine呈紅色熒光表達，細胞核均被DAPI染成藍色。
　　2.4掃描電鏡觀察結果
　　結

53、果顯示，橫斷面尚可見雙層細胞結構，內表面可見誘導形成的血管內皮細胞（VEC）均勻分布且與支架具有良好的生物相容性，細胞與細胞之間呈鋪路石樣結構。
　　3裸鼠體內動態(tài)強化實驗結果
　　3.1標本大體觀察
　　3周時，單純支架組和細胞支架組均位于裸鼠的皮下，周圍有極薄的裸鼠組織包裹，管腔坍塌，管腔中間有少量裸鼠組織長入；6周時，管型結構完整，裸鼠組織長入，使得管壁相對增厚，管腔中間有裸鼠組織長入；9周時，管型結構仍然完整，

54、周圍和中間的裸鼠組織包裹增厚更明顯。
　　3.2組織學觀察
　　HE染色可見，3周時，單純支架組管壁結構清晰，周圍有少量纖維組織包繞和少量炎細胞浸潤；細胞支架組管壁中有大量種植細胞和少量裸鼠細胞長入，周圍有少量纖維組織包繞和大量炎細胞浸潤。6周時，單純支架組有少量降解，管壁中有裸鼠細胞長入，周圍少量炎細胞浸潤；細胞支架組管壁中有大量細胞，結構清晰，周圍有纖維組織包繞，炎細胞浸潤減少。9周時，單純支架組逐漸降解，周圍有大量纖維

55、結締組織包繞和少量炎細胞浸潤；細胞支架組管壁仍然十分清晰，管壁中有大量細胞，大部分來源于誘導形成的血管平滑肌細胞（VSMC）和血管內皮細胞（VEC），少數來源于裸鼠細胞的長入，周圍少量纖維組織包繞，炎細胞浸潤幾乎看不到。
　　3.3 EdU Apollo488和DAPI熒光染色示蹤細胞結果
　　實驗組裸鼠皮下植入培養(yǎng)9周后，ACVM-0.25% HLC-I支架上誘導血管平滑肌細胞（VSMC）被EdU Apollo488標記呈

56、綠色熒光，誘導血管內皮細胞（VEC）被EdU Apollo488標記呈綠色熒光，同時被DAPI標記呈藍色熒光，證實這些細胞來源于之前種植于支架的種子細胞。
　　3.4壓力承受實驗測定結果
　　ACVM-0.25%HLC-I支架組與組織工程化血管組相比，具有統(tǒng)計學差異（ P<0.05）；組織工程化血管組與正常血管組相比，無統(tǒng)計學差異（P>0.05）
　　結論：
　　1人牙齦成纖維細胞（ HGFs）能在體外誘導分化為

57、血管內皮細胞（VEC）。
　　2人牙齦成纖維細胞（HGFs）能在體外誘導分化為血管平滑肌細胞（VSMC）。
　　3類人 I型膠原蛋白（HLC-I）與兔脫細胞血管基質（ACVM）聯(lián)合制備的 ACVM-0.25%HLC-I支架材料具備充分的促進細胞粘附，細胞增殖和細胞遷移能力以及良好的機械性和生物力學性能。
　　4人牙齦成纖維細胞（HGFs）誘導分化為血管平滑肌細胞（VSMC）和血管內皮細胞（VEC），分層種植于ACVM-