基于細胞膜片技術構建組織工程化骨實驗研究.pdf

1、骨組織工程研究為腫瘤切除、創(chuàng)傷、先天性畸形等所致骨缺損的修復提供了新思路，其中種子細胞是核心問題之一。本研究以骨髓間充質成骨細胞為種子細胞，通過體外培養(yǎng)，構建出骨髓間充質成骨細胞膜片。并提出了新的骨髓間充質成骨細胞聚集體構建方法——骨髓間充質成骨細胞膜片(Bonemarrowstromalosteoblastcellsheet)技術，其主要策略是提取骨髓間充質干細胞，體外擴增后，誘導為骨髓間充質成骨細胞，體外擴增純化骨髓間充質成骨細胞，

2、按照特定的培養(yǎng)程序在體外構建出骨髓間充質成骨細胞膜片，擴增的骨髓間充質成骨細胞在細胞分泌的細胞外基質表面實現(xiàn)三維立體生長，它的特點在于：①本研究構建的骨髓間充質成骨細胞膜片分為三層：富含基質層、中間層和富含細胞層，從而使形成的細胞膜片具有生長的動力性和方向性；②保持了擴增細胞良好的功能表型，在細胞數(shù)量增加的同時兼顧了細胞的分化能力；③良好的生物相容性和低免疫源性；④較高的種子細胞利用效率；⑤通過與天然支架材料支撐賦形，可以進行特定形態(tài)的

3、組織構建。
　　本研究對構建骨髓間充質成骨細胞膜片的理化性質、組織學結構和生化成分進行了分析；通過體外三維構建和動物實驗評估了骨髓間充質成骨細胞膜片在體外形成骨樣組織的能力和在體內形成特定形態(tài)骨樣組織的能力。進而提出新的骨髓間充質成骨細胞膜片構建策略，研究不同形態(tài)骨樣組織的構建方法，探索新的體外構建移植體修復骨缺損的思路。
　　實驗一骨髓充成骨胞膜片間質細體外建構
　　目的：本實驗對構建骨髓間充質成骨細胞膜片組織學結構

4、和生化成分進行了分析；通過體外三維構建評估了骨髓間充質成骨細胞膜片體外骨樣組織的形成能力。方法：骨髓間充質成骨細胞膜片的體外構建：切取兔四肢長骨干骺端，通過離心分層法制備原代骨髓間充質干細胞，將原代細胞進行細胞計數(shù)并分為六等分，平均接種至六個75cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶底壁有80％被骨髓間充質干細胞貼滿后，加入誘導液。待細胞長滿皿底，消化，搜集細胞。將獲取細胞高密度接種至三個九厘米直徑培養(yǎng)皿中。孵育十四天后，觀察骨髓間充質成骨細胞膜片的形

5、成情況，并進行組織學染色和電鏡觀察。結果：經(jīng)過體外孵育，骨髓間充質成骨細胞膜片為半透明膜狀物，有彈性，內富含有質硬的白色結節(jié)，可用金屬鑷鉗夾操作。HE染色證實有骨基質形成，并形成類似骨陷窩樣的組織結構。Vonkossa染色證實有礦化成分在基質中合成。觀察：發(fā)現(xiàn)骨髓間充質成骨細胞膜片分為三層：富含基質層、中間層和富含細胞層。結論：提出骨髓間充質成骨細胞膜片的兩極學說（靜止極和增殖極），建立了一種新的骨髓間充質成骨細胞膜片構建技術，骨髓間充

6、質成骨細胞膜片是一種由骨髓間充質成骨細胞和基質（自行分泌）組成的聚集體，相信它在進一步的體外自體骨移植體的構建中具有廣闊的應用價值。
　　實驗二骨髓充成骨胞膜片/狀間質細管珊瑚合體移植裸鼠復皮下成骨實驗研究
　　目的：在新的骨髓間充質成骨細胞膜片構建技術下，觀察骨髓間充質成骨細胞膜片在無免疫動物體內發(fā)育成管狀骨樣組織的能力。方法：靜態(tài)培養(yǎng)條件下，骨髓間充質成骨細胞膜片的靜止極朝向管狀天然珊瑚，將其均勻纏繞在管狀珊瑚外表面，進

7、行卷層樣復合，經(jīng)體外孵育4周后，觀察聚集體之間的融合情況，并通過組織學染色觀察組織成熟情況。最后將骨髓間充質成骨細胞膜片/珊瑚復合體植入裸鼠皮下，分為8周組、12周組，了解成骨情況。結果：大體觀察，體外孵育四周后，在管狀珊瑚體外周部分的骨髓間充質成骨細胞膜片卷層之間發(fā)生了組織融合，并形成了較成熟的骨樣組織，而在管狀珊瑚體的中央部分，有非常明顯成熟的骨樣組織形成。結論：在良好營養(yǎng)交換的環(huán)境下，骨髓間充質成骨細胞膜片具備繼續(xù)成熟并發(fā)育為骨樣

8、組織的能力，調整骨髓間充質成骨細胞膜片的卷層方向（靜止極和增殖極的朝向）可為骨髓間充質成骨細胞膜片的體外三維構建提供新的塑形方法。
　　實驗三骨髓充成骨胞膜片/種植體/間質細珊瑚合體移植裸鼠復皮下成骨實驗研究
　　目的：利用新的骨髓間充質成骨細胞膜片構建技術，在無免疫動物體內構建出內有種植體的骨樣組織，以探索骨髓間充質成骨細胞膜片體內構建帶有種植體骨樣組織的可行性。方法：按實驗一所述方法構建出的骨髓間充質成骨細胞膜片后，以構

9、建好的種植體/珊瑚復合體為賦形支撐體，骨髓間充質成骨細胞膜片的增殖極朝向種植體/珊瑚復合體，將其均勻纏繞在種植體/珊瑚復合體外表面。體外孵育四周后，觀察聚集體之間的融合情況，最后將骨髓間充質成骨細胞膜片/種植體/珊瑚復合體植入裸鼠皮下，在8周后，取出標本。從大體形態(tài)、組織學結構等方面評價形成骨樣組織情況。結果：通過此策略構建的骨髓間充質成骨細胞膜片/種植體/珊瑚復合體具有良好的生物相容性。形成的骨樣組織保持著良好的初始外形，組織學結構類

10、似于天然骨組織，含有豐富的礦化物質和膠原纖維。結論：骨髓間充質成骨細胞膜片在體內具有良好的骨樣組織形成能力。形成的組織結構均勻，細胞表型維持良好，并為下一步頜骨缺損修復探索了新的方法。
　　實驗四骨髓充成骨胞膜片附移植實驗研究間質細貼
　　目的：研究骨髓間充質成骨細胞膜片貼附后成骨的構建方法。方法：按實驗一所述方法構建出骨髓間充質成骨細胞膜片后，以圓片狀珊瑚為支撐體，將其均勻平鋪在珊瑚一面。體外短時間孵育，使骨髓間充質成骨細

11、胞膜片與珊瑚牢靠貼附后，將構建的圓片狀移植體植入細胞供體動物（新西蘭兔）去除骨膜的顱骨表面。體內孵育8周、12周后，取出標本。從大體形態(tài)、組織學結構等方面了解貼附成骨情況。結果：通過上述策略，可以形成形態(tài)穩(wěn)定的圓盤狀骨樣組織，有一定的機械性能，有大量的新骨樣組織形成。結論：此策略所形成的貼附后骨樣組織與膜狀成骨、軟骨成骨貼附移植后的情況不同。
　　實驗五骨間質髓充成骨胞膜片復兔顱極細修骨限缺的損實驗研究
　　目的：運用骨髓間

12、充質成骨細胞膜片技術，探索在無支撐體條件下修復兔顱骨極限缺損的方法。方法：按實驗一所述方法構建出骨髓間充質成骨細胞膜片。同時設自體髂骨移植的陽性對照組和單純珊瑚材料的陰性對照組。將其分別植入兔顱骨極限缺損處，8周和12周后采用X線片，HE染色、Masson’s三色染色法等觀察、比較骨缺損修復的情況。結果：組織學結構顯示骨髓間充質成骨細胞膜片構建出了骨樣組織。骨髓間充質成骨細胞膜片修復顱骨缺損的能力強，且與自體髂骨修復的情況相近。珊瑚組材

13、料無成骨能力。結論：骨髓間充質成骨細胞膜片構建的組織工程骨可成為一種良好的骨缺損修復材料。
　　實驗六骨髓充成骨胞膜片/種植體/間質細珊瑚合體修復復頜羊下?lián)p實驗研骨缺的究
　　目的：利用新的骨髓間充質成骨細胞膜片構建技術，探索構建特定形態(tài)大塊骨樣組織的思路，并進行大動物下頜骨缺損修復。方法：以山羊為動物模型，按實驗一所述方法構建出骨髓間充質成骨細胞膜片后，以珊瑚為支撐體構建山羊部分下頜骨外形，并將種植釘放入支撐材料中，用此珊

14、瑚/種植釘作為骨髓間充質成骨細胞膜片內支撐體。骨髓間充質成骨細胞膜片的增殖極朝向支撐體，然后，將骨髓間充質成骨細胞膜片小心纏繞在內支撐體外周。進行體外孵育4周后。將此方法獲得的部分下頜骨移植體植入制作好的供體動物下頜骨缺損處，12周后，取出標本，進行大體外形、組織學形態(tài)觀察，了解大動物下頜骨缺損修復情況。結果：通過此策略，在內支撐體外構建的移植體具有穩(wěn)定的外形，能在動物缺損部位形成理想的外形，組織學結構顯示構建的骨樣組織具有較好的質量。