應(yīng)用軟骨脫細(xì)胞膜片構(gòu)建軟骨的實驗研究.pdf

1、軟骨組織的再生能力低，所以軟骨缺損或畸形一直是臨床治療的難題，組織工程技術(shù)的發(fā)展為軟骨修復(fù)提供了新的治療手段。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為天然材料有望成為組織工程軟骨構(gòu)建的理想支架，但是由于它是致密的結(jié)締組織，細(xì)胞不易完全脫除，后續(xù)細(xì)胞長入也有困難，因而限制了其在該領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　 本研究對軟骨脫細(xì)胞材料在軟骨組織工程中的應(yīng)用提出了新的方法--應(yīng)用軟骨膜片的形式進(jìn)行脫細(xì)胞處理，以“三明治”法復(fù)合軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨構(gòu)建，從而解決了傳統(tǒng)軟骨脫

2、細(xì)胞材料應(yīng)用的難題。
　　 課題分四部分對軟骨脫細(xì)胞膜片開展了系列研究。
　　 第一章軟骨脫細(xì)胞膜片的制備和組織學(xué)檢測
　　 方法：應(yīng)用豬耳軟骨連續(xù)切片獲得10μm和30μm兩種厚度的軟骨膜片，經(jīng)1％SDS脫細(xì)胞后漂洗、凍干，對脫細(xì)胞程度進(jìn)行評價，評價手段主要為兩種：HE染色和DAPI染色，并應(yīng)用掃描電鏡對膜片和接種細(xì)胞后的膜片進(jìn)一步鑒定。結(jié)果：經(jīng)HE染色和DAPI染色鑒定，軟骨膜片經(jīng)脫細(xì)胞后軟骨陷窩內(nèi)無軟骨細(xì)胞

3、，掃描電鏡進(jìn)一步確定了這個結(jié)果，10μm膜片通透性比30μm好，膜片和細(xì)胞組織相容性好。
　　 第二章應(yīng)用“三明治”法復(fù)合軟骨細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織
　　 方法：將從豬耳廓分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞分別以25、50、100、200×106/ml重懸，5μl一滴與10μm或30μm軟骨脫細(xì)胞膜片以“三明治”法層層疊加20層構(gòu)建軟骨，體外培養(yǎng)4周后，構(gòu)建后的軟骨進(jìn)行組織學(xué)鑒定，以得出合適的接種細(xì)胞濃度和膜片厚度，再利用這個結(jié)果，進(jìn)一步比較

4、體外培養(yǎng)和植入裸鼠體內(nèi)后軟骨形成差異，利用10μm膜片接種密度為100×106/ml構(gòu)建軟骨，分四組：體外培養(yǎng)4周、體外培養(yǎng)16周、體外培養(yǎng)4周+植入體內(nèi)4周、體外培養(yǎng)4周+植入體內(nèi)12周，分別比較HE、藏紅花、甲苯胺藍(lán)、Ⅱ膠原染色和彈性模量。結(jié)果：利用10μm膜片接種密度為100×106/ml構(gòu)建的軟骨效果較好，植入體內(nèi)后軟骨表型穩(wěn)定，材料降解明顯，植入12周后彈性模量可達(dá)正常軟骨的87％左右。
　　 第三章利用軟骨脫細(xì)胞膜片

5、技術(shù)構(gòu)建一定形態(tài)的軟骨
　　 方法：預(yù)先制備設(shè)計軟骨脫細(xì)胞膜片為圓形、三角形、長方形，應(yīng)用“三明治”法層層疊加構(gòu)建相應(yīng)形態(tài)軟骨，體外培養(yǎng)4周后組織學(xué)檢驗；或?qū)⒅谱骱玫哪て蛙浌羌?xì)胞貼附于人耳形態(tài)的鈦支架上，體外培養(yǎng)2天后植入裸鼠4周。結(jié)果：形成的組織工程軟骨形態(tài)與預(yù)制的膜片形態(tài)一致，無收縮變形；植入裸鼠體內(nèi)的人耳形狀細(xì)胞-材料復(fù)合物能形成完整形態(tài)的組織工程人耳形狀軟骨。
　　 第四章軟骨脫細(xì)胞膜片的免疫原性研究
　

6、　 方法：以羊作為模型，將來自于自體、同種異體(異體羊)、異種(豬)軟骨脫細(xì)胞膜片復(fù)合羊自體軟骨細(xì)胞構(gòu)建的組織植入在羊體內(nèi)，植入體內(nèi)4周后組織學(xué)檢查軟骨形成和評價免疫反應(yīng)程度。結(jié)果：同種異體的膜片構(gòu)建的軟骨較異種的好，可用于大動物的軟骨組織工程構(gòu)建。
　　 本研究創(chuàng)新性地應(yīng)用軟骨脫細(xì)胞膜片復(fù)合“三明治”法構(gòu)建組織工程軟骨，脫細(xì)胞基質(zhì)為組織構(gòu)建提供了天然的支架，這一方法可以用于指導(dǎo)其他組織的構(gòu)建，大動物實驗初步表明同種異體的膜片