間充質(zhì)源性腫子細(xì)胞復(fù)合異體脫細(xì)胞軟骨構(gòu)建軟骨組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 軟骨缺損一直是臨床工作的一大難題，自體軟骨來源少，異體軟骨吸收明顯，均限制了同種軟骨組織的應(yīng)用，近年組織工程的研究發(fā)展為這一難題的解決帶來了新的機(jī)遇，大量軟骨組織工程的研究，帶動(dòng)了人工軟骨時(shí)代的到來。本實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)外周血源性間充質(zhì)干細(xì)胞獲得軟骨種子細(xì)胞.分離異體兔肋軟骨獲取脫細(xì)胞軟骨，兩者共同培養(yǎng)以構(gòu)建新型軟骨組織，為臨床修復(fù)器官缺損及再造提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 創(chuàng)建新西蘭兔創(chuàng)傷模

2、型，提取兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞，體外行干細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇及誘導(dǎo)分化成軟骨。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)生長良好的第三代間充質(zhì)干細(xì)胞14d獲得軟骨種子細(xì)胞，顯微鏡下觀察各期細(xì)胞生長特性及形態(tài)特征，制作種子細(xì)胞爬片行甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)；聯(lián)合中性去垢劑-酶法獲得同種異體兔肋軟骨脫細(xì)胞支架，制備石蠟切片行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)，鏡下觀察染色結(jié)果；制備掃描電鏡樣本，掃描電鏡下觀察支架形態(tài)與結(jié)構(gòu)。自體間充質(zhì)源性軟骨

3、種子細(xì)胞與異體脫細(xì)胞軟骨體外復(fù)合培養(yǎng)7d獲得復(fù)合軟骨，將復(fù)合軟骨植入自體實(shí)驗(yàn)兔皮下，根據(jù)植入材料的差異分為A、B、C、D四組(A組：植入異體新鮮軟骨B組：植入脫細(xì)胞軟骨C組：植入復(fù)合軟骨D組：體外培養(yǎng)復(fù)合軟骨)，植入材料于植入后6w、12w取出，制備石蠟切片行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、MASSON染色，鏡下觀察染色結(jié)果；制備掃描電鏡樣本，掃描電鏡下觀察種子細(xì)胞與支架的生物相容性。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變外周

4、血來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3d-3.5d半量換液，可見少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形或紡錘形，12-14d細(xì)胞已鋪滿皿底80-90％。1：2或1：3傳代后細(xì)胞生長迅速，呈長梭形或多角形，5-6d即可鋪滿皿底80％-90％。復(fù)蘇后第三代干細(xì)胞貼壁時(shí)間較凍存前延長，形態(tài)基本相同，呈長短梭形或多角形，5-7d即可傳代。外周血來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，較對(duì)照組生長明顯減慢，細(xì)胞團(tuán)中央部分細(xì)胞呈類圓形或多角形，培養(yǎng)14d細(xì)胞增殖仍很緩慢，類圓形細(xì)胞逐

5、漸增多。對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)明顯接觸抑制。甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：干細(xì)胞誘導(dǎo)14d，胞漿內(nèi)有較多酸性黏多糖、軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原基質(zhì)分泌。
　　 2.脫細(xì)胞軟骨支架觀察兔脫細(xì)胞軟骨呈乳白色，結(jié)構(gòu)完整、孔隙均勻，組織學(xué)染色、掃描電鏡觀察顯示起其仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型膠原成分，其孔隙率為(61.31±8.45)％；孔徑長度為(32.80±5.15)μm。組織學(xué)染色及掃描電鏡觀察均顯示脫細(xì)胞軟骨具有良好的三維立體孔

6、徑結(jié)構(gòu)。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果種子細(xì)胞與脫細(xì)胞軟骨體外復(fù)合7d，初步獲得復(fù)合軟骨，掃描電鏡示支架與種子細(xì)胞黏附良好，細(xì)胞伸出偽足貼附于支架表面，并伴有多量基質(zhì)分泌。將各組實(shí)驗(yàn)材料植入兔背皮下后，6w、12w分別取出，各項(xiàng)觀察結(jié)果示：B、C組材料與生物體具有良好的相容性，C組材料在生物體內(nèi)可逐漸降解吸收，并可形成少量乳白色類軟骨組織。
　　 結(jié)論：
　　 1.兔外周血來源廣泛，外周血間充質(zhì)干細(xì)胞提取方便，體外生長

7、良好，具有良好的自我更新能力與分化潛能，是良好的軟骨組織工程種子細(xì)胞來源。第三代外周血間充質(zhì)干細(xì)胞生長良好，適合行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成軟骨細(xì)胞。
　　 2.兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外適宜條件下凍存及復(fù)蘇前后，其生物學(xué)活性未見明顯差異?？衫迷撎匦赃M(jìn)行長期儲(chǔ)存，為后期應(yīng)用提供支持。
　　 3.兔肋軟骨經(jīng)聯(lián)合中性去垢劑-酶法脫細(xì)胞處理，仍具有良好的三維立體空間構(gòu)架、良好的基質(zhì)構(gòu)成、良好的孔徑長度及均勻的孔隙率，且與種子細(xì)胞具有良好