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文檔簡介
1、目的: 1探討體外提取分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)的方法。 2尋求更好的關(guān)節(jié)軟骨生物支架材料,使其在孔隙率,比表面積,彈性模量等物理特性和細胞毒性、溶血試驗、生物降解性等生物相容性方面更接近天然軟骨支架材料的要求。 3探討異種異體脫細胞軟骨支架材料(acellular cartilage material,ACM)復(fù)合同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細胞(rabbit bone marrow-derived me
2、senchymal stem cells,rBMSC)修復(fù)兔股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。 方法: 1采用密度梯度離心和差速貼壁法獲得兔骨髓間充質(zhì)干細胞.鏡下觀察細胞生物學形態(tài)及生長狀態(tài),細胞計數(shù)板下對第1、3、5代細胞計數(shù),繪制細胞生長曲線,細胞表面抗原標記對其進行純度分析。 2①將豬膝關(guān)節(jié)軟骨凍干加工為粉末,胰酶消化,曲拉通洗脫,蒸餾水洗凈凍干,紫外線照射(UVI)后成型。電鏡觀察孔徑分布,壓汞儀測定孔隙率等參
3、數(shù);②細胞毒性測定:材料浸提液培養(yǎng)細胞進行細胞形態(tài)大體觀察,MTT法觀察細胞活性;③急性全身毒性反應(yīng):材料浸提液注射入SD大鼠腹腔觀察材料對動物表現(xiàn)及體重變化的影響;④溶血試驗:材料浸提液與稀釋動物鮮血混合觀察紅細胞溶解情況,492nm下檢測OD值計算相對溶血率;⑤觀察細胞復(fù)合材料共培養(yǎng)情況并將材料埋植于動物皮下檢測材料的生物降解性。 3①密度梯度離心和差速貼壁法獲得原代兔BMSC。選擇第三代BMSC作為種子細胞;②利用冷凍干燥
4、、胰酶消化和化學去垢劑等方法制備脫細胞軟骨支架材料;③3月齡新西蘭兔內(nèi)髁制備直徑4mm,深3mm.動物關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,24只新西蘭兔以2個時間段隨機分為3組,Ⅰ ACM-BMSC組:第三代BMSC 1×106個/mL與ACM于37℃、5%CO2飽和濕度復(fù)合48h;ⅡACM組;Ⅲ空白對照組;④移植6,12周后大體及組織學觀察,免疫組化染色觀察修復(fù)組織Ⅱ型膠原,Wakitani評分評估修復(fù)效果。 結(jié)果: 1原代培養(yǎng)的BMS
5、C呈圓形、梭形、多角形等,48h可見貼壁細胞有伸展現(xiàn)象,呈梭形,多角形,成纖維細胞樣展開,細胞核清晰,14d左右可達90%融合;1、3、5代骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線:細胞貼壁48h增殖緩慢,處于潛伏期;對數(shù)增殖期為3~4d,第6d后進入平臺期;,③第2代BMSC CD44表達陽性,標記率為93.0%。 2①脫細胞生物支架材料為白色,略微發(fā)黃,外表呈多孔疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。脆性大,有一定的彈性??紫堵蕿?8.54%,平均孔徑為47.1
6、3岬;②細胞毒性試驗:24h、48h、72h各時間段內(nèi)三組細胞OD值兩兩比較(P>0.05),無顯著差異,ACM細胞毒性為0級;③動物急性毒性實驗:Ⅰ生物材料處理組和Ⅱ生理鹽水處理組對動物體重影響沒有差異(P>0.05),Ⅰ生物材料處理組和Ⅲ苯酚處理組對動物體重有顯著差異(P<0.05);④溶血試驗:材料的相對溶血率為2.92%,低于5%的標準,沒有明顯溶血現(xiàn)象;⑤材料直接接觸試驗:細胞嵌入軟骨支架材料中,細胞成圓形和橢圓形,部分細胞可
7、見細胞核,材料成顆粒狀,染色均一;動物皮下埋植:組織學觀察可見試樣周圍存在少量淋巴細胞和嗜中性粒細胞,致密纖維囊壁將復(fù)合細胞的材料包裹,材料被降解為細小顆粒,細胞均勻散在材料中成橢圓形,可見分裂相。 3①大體觀察及組織學觀察:6和12周ⅠACM-BMSC組再生組織與正常關(guān)節(jié)軟骨面平齊,修復(fù)部位表面較平整,界限模糊,接近正常軟骨。Ⅱ ACM組修復(fù)組織表面不平整并有明顯下陷,修復(fù)組織全層可見成纖維樣細胞,深層可見極少數(shù)透明軟骨樣細胞
8、。Ⅲ空白曠置組未見明顯修復(fù),肉芽組織形成伴成纖維樣細胞增生;②Wakitani組織學評分可見在不同的時間段內(nèi)Ⅰ和Ⅱ組均低于Ⅲ組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Ⅰ和Ⅱ組間組織學評分統(tǒng)計學無顯著差異(P>0.05);③免疫組織化學: ACM.BMSC組修復(fù)組織的細胞為軟骨樣細胞,可見柱狀排列,周圍軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原染色陽性。 結(jié)論: 1依據(jù)實驗方法,BMSC可以較快良好的生長,且純度較高,為BMSC的研究提供方便的提取和培
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