骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），了解其生長特點(diǎn)。確證堿性成纖維生長因子對(duì)于MSCs增殖的促進(jìn)作用，并與MSCs和纖維蛋白凝膠共同移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，觀察其軟骨修復(fù)狀況。
　　 方法:選用6-8月齡新西蘭大白兔，從脛骨和腓骨沖洗得骨髓，以淋巴細(xì)胞分離液分離的方法獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，觀察其生長特點(diǎn)。并用不同濃度的bFGF溶液與MSCs共培養(yǎng)，分別在一周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)用MTT法檢測(cè)bFGF對(duì)于MSCs增

2、殖的促進(jìn)作用。將MSCs在6孔板中鋪板后，分別加入不同濃度的Brdu溶液和CFDA溶液，并分別在不同的時(shí)間點(diǎn)用熒光染色相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，測(cè)定標(biāo)記率。分別將含bFGF的MSCs混懸液和MSCs細(xì)胞懸液與纖維蛋白原，凝血酶，氨甲環(huán)酸，CFDA標(biāo)記物的混懸液混合，制得MSCs纖維蛋白凝膠。以bFGF復(fù)合MSCs纖維蛋白凝膠組為A組，單純MSCs纖維蛋白凝膠組為B組，單純兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組為C組，分別在4周，8周，12周用大體

3、觀察，HE染色，甲苯胺藍(lán)染色，Masson染色及組織工程學(xué)評(píng)分的方法觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處軟骨修復(fù)的狀況。
　　 結(jié)果:原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種后生長迅速，12～14天細(xì)胞長成單層，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞形成多層生長。細(xì)胞傳代后仍保持成纖維細(xì)胞樣外形。P5代后細(xì)胞生長速度較P3代細(xì)胞略減慢。繪制生長曲線可以見三代細(xì)胞生長周期基本一致，均為接種培養(yǎng)后前二三天，生長較緩慢，為生長遲滯期。三天后細(xì)胞生長加速，有一快速增長過程，達(dá)

4、到對(duì)數(shù)生長期，于七八天時(shí)，細(xì)胞數(shù)達(dá)最高值，為生長平臺(tái)期，其后生長速度減緩，細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示低濃度bFGF（1.0～10ng/ml）隨濃度增加促進(jìn)MSCs增殖，當(dāng)bFGF濃度大于10ng/ml時(shí)促增殖作用下降。以不同濃度標(biāo)記發(fā)現(xiàn) 10umol/L的 Brdu 最終標(biāo)記率>95％，與 15umol/L的 Brdu 沒有顯著差別，與 5umol/L有顯著差異。隨著標(biāo)記時(shí)間延長陽性細(xì)胞數(shù)增多標(biāo)記 72 h 細(xì)胞陽性率 >

5、94％，但標(biāo)記時(shí)間繼續(xù)延長標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目無明顯增多。而用CFDA標(biāo)記MSCs，培養(yǎng)四小時(shí)后發(fā)現(xiàn)2 umol/l組的細(xì)胞標(biāo)記率就已經(jīng)達(dá)到了97％以上，與更大濃度組沒有顯著差異，與1 umol/l組有顯著差異。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合bFGF修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)果觀察顯示4周后，A組軟骨缺損內(nèi)被白色透明膜樣組織部分充填，缺損深部由類似于透明軟骨的修復(fù)組織所填充、可見大量軟骨細(xì)胞位于特異性陷窩內(nèi)，甲苯胺藍(lán)和Masson染色后均未見明顯的軟骨細(xì)胞外

6、基質(zhì)形成。B組軟骨缺損內(nèi)雖也有膜樣物質(zhì)充填，但顏色明顯發(fā)紅，與周圍軟骨界限明顯。C組軟骨缺損內(nèi)主要由暗紅色組織組成，甲苯胺藍(lán)和Masson染色染色陰性。8周后，A組修復(fù)組織色澤灰白，表面平整，與周圍組織整合較好，但可清楚分辨出缺損處的邊界。修復(fù)組織由軟骨樣細(xì)胞構(gòu)成，出現(xiàn)軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，細(xì)胞數(shù)量多，排列不規(guī)則。甲苯胺藍(lán)染色陽性基質(zhì)含量較高，Masson染色示膠原染色陽性。B組缺損處修復(fù)組織顏色發(fā)白，表面較平整，與周圍組織整合較好。甲苯胺藍(lán)染

7、色陽性基質(zhì)較前組為少，Masson染色染色弱陽性。C組修復(fù)區(qū)為纖維狀物覆蓋，顏色不均一。C組缺損區(qū)為纖維組織覆蓋，表面明顯凹陷，修復(fù)區(qū)邊緣部分甲苯胺藍(lán)染色及Masson染色弱陽性。12周后，A組修復(fù)的關(guān)節(jié)面較光滑，修復(fù)組織與周圍軟骨基本整合，色澤相近，辨認(rèn)困難，修復(fù)組織表面平整，和周圍軟骨整合緊密、厚度相近，甲苯胺藍(lán)染色在缺損修復(fù)表面可以見到與鄰近軟骨相連續(xù)的排列規(guī)整的異染質(zhì)，Masson染色示膠原染色陽性。B組修復(fù)處表面仍不完全平整，

8、色澤發(fā)白，但修復(fù)組織質(zhì)地仍較軟。甲苯胺藍(lán)染色也可見到異染質(zhì)，但出現(xiàn)分層現(xiàn)象，且與鄰近軟骨不連續(xù)，Masson染色示膠原染色弱陽性。C組缺損處凹陷為纖維狀物覆蓋。缺損區(qū)表面凹陷，與正常軟骨連接處表面纖維組織毛糙，細(xì)胞外基質(zhì)排列紊亂，甲苯胺藍(lán)染色和Masson染色僅在修復(fù)組織的底部見到少量的異染質(zhì)和膠原染色陽性。術(shù)后12周組織工程評(píng)分A組，B組，C組分別為11.35±1.69，8.29±1.98，2.97±1.24。
　　 結(jié)論:<

9、br>　　 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞運(yùn)用于軟骨修復(fù)研究的可行性存在，擴(kuò)增方便迅速，修復(fù)軟骨缺損有效，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 2.bFGF是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長分化重要的細(xì)胞因子，對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促增殖作用顯著，在體內(nèi)可以促進(jìn)軟骨組織形成。
　　 3.CFDA SE標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記率高，且觀察方法簡(jiǎn)便，不影響細(xì)胞增殖分化能力，可以應(yīng)用于軟骨組織工程研究。
　　 4．加入了氨甲環(huán)酸的纖維蛋白凝膠具有較