應用脂肪干細胞修復豬膝關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、本文論述了應用脂肪干細胞修復豬膝關節(jié)軟骨缺損的實驗研究。 各種原因造成的關節(jié)軟骨損傷性疾病在修復重建外科中很常見。由于軟骨自身結構的特殊性，關節(jié)軟骨的自我修復能力非常有限，損傷后的關節(jié)軟骨一般由纖維組織或者纖維軟骨所修復。目前常用的軟骨或人工代用品移植修復等方法均存在許多問題,不能修復重建關節(jié)軟骨原有的透明軟骨結構。自體軟骨細胞移植修復軟骨缺損是效果比較肯定的一種治療方法，但是自體軟骨細胞移植也存在如細胞供區(qū)不足、體外培養(yǎng)周期長

2、、供區(qū)易發(fā)生病變和軟骨細胞表型不易保持等缺點。因此，這一方法的使用受到了限制。組織工程的興起與發(fā)展為軟骨缺損的治療提供了新的思路和方法。 脂肪干細胞（Adipose-Derived Stem Cells , ADSCs）是間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）中研究較多的種子細胞之一。有大量的研究表明脂肪干細胞在體外特定條件下，能夠向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)細胞等分化。同時，Zuk等對脂

3、肪干細胞的軟骨分化能力做了比較全面的研究，指出脂肪干細胞在特定條件下能向軟骨細胞誘導分化。 但是，應用ADSCs作為種子細胞修復大動物關節(jié)軟骨缺損的研究罕有報道。ADSCs是否能作為組織工程種子細胞，并用于修復大動物關節(jié)軟骨缺損，目前尚未明確。因此，探討以自體ADSCs為種子細胞，PGA/PLA為支架材料，應用組織工程方法修復豬膝關節(jié)軟骨缺損的可行性。 此外，應用自體ADSCs作為種子細胞，和其它種子細胞一樣，仍然會對患

4、者機體造成新的創(chuàng)傷，獲取脂肪組織會造成患者疼痛不適，更重要的是患者必須等待一段時間才能得到構建組織的治療，不能滿足急性病患者的需要。因此，探討應用同種異體成體干細胞作為種子細胞一直是組織工程領域的重要研究方向。 前期的研究發(fā)現(xiàn)同種異體ADSCs具有特殊的免疫學特性，在體外能夠抑制混合淋巴細胞反應。但是，成軟骨誘導后的同種異體ADSCs是否能夠修復大動物關節(jié)軟骨缺損還有待進一步的研究。因此，我們探討以同種異體ADSCs為種子細胞，

5、PGA/PLA為支架材料，應用組織工程方法修復豬膝關節(jié)軟骨缺損的可行性，同時對其免疫學機制進行初步探討。 目的： 探討應用自體ADSCs和同種異體ADSCs作為種子細胞、PGA/PLA作為支架材料構建組織工程軟骨修復豬膝關節(jié)軟骨缺損的可行性。 方法： 1.豬ADSCs體外多向分化潛能的實驗研究：對豬脂肪組織中分離的基質(zhì)細胞觀察體外增殖能力，并收集第二代ADSCs分別進行成骨誘導培養(yǎng)、成軟骨誘導培養(yǎng)和成脂

6、肪誘導培養(yǎng)，通過免疫熒光檢測和RT-PCR檢測，觀察其多向分化潛能。 2.PGA/PLA支架材料與細胞相容性的實驗研究：細胞材料復合后應用Hoechest方法檢測其生長曲線，DiO標記細胞后接種在材料上，觀察細胞生長情況；掃描電鏡觀察細胞材料復合物的粘附情況，細胞材料復合物成軟骨誘導后檢測GAG含量。 3.自體ADSCs修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：以自體ADSCs為種子細胞，以聚羥基乙酸/聚乳酸（Poly

7、glycolic Acid / Polylactic Acid, PGA/PLA）為支架材料，對豬膝關節(jié)非負重區(qū)軟骨缺損進行修復。以自體ADSCs-PGA/PLA復合物為實驗組，以單純的PGA/PLA材料為對照組，術后3、6個月取材，行大體觀察、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色和甲苯胺藍染色觀察其修復情況。 4.自體ADSCs修復豬膝關節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：以自體ADSCs為種子細胞，以PGA/PLA為支架材料，對豬膝

8、關節(jié)負重區(qū)軟骨缺損進行修復。以自體ADSCs-PGA/PLA復合物為實驗組，以單純的PGA/PLA材料為對照組，術后3、6個月取材，行大體觀察、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色和甲苯胺藍染色觀察其修復情況。 5.同種異體ADSCs修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)及負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：以成軟骨誘導的同種異體ADSCs為種子細胞，以PGA/PLA為支架材料，對豬膝關節(jié)非負重區(qū)和負重區(qū)軟骨缺損進行修復。以同種異體ADSCs-PGA/PL

9、A復合物為實驗組，以單純的PGA/PLA材料為對照組，術后3、6個月取材，行大體觀察、HE染色觀察修復情況，并檢測細胞移植后免疫學相關指標變化。 結果： 1.豬ADSCs體外多向分化潛能的實驗研究：豬ADSCs在體外誘導條件下能夠向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化。 2.PGA/PLA支架材料與細胞相容性的實驗研究：細胞生長曲線測定表明細胞在材料上生長良好；DiO標記表明細胞在材料上呈團狀生長，并隨時間延

10、長而逐漸增加；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PLA在PGA材料中呈網(wǎng)狀或絲狀分布，并把PGA纖維連成一體，能很好的起到塑型作用；細胞與材料粘附良好，分泌大量的細胞基質(zhì)包裹PGA/PLA；體外成軟骨誘導的ADSCs-PGA/PLA復合物有GAG的表達，并在第2周時達最高峰。 3.自體ADSCs修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：術后3、6個月分別取材顯示，實驗組關節(jié)軟骨缺損區(qū)有軟骨樣組織填充。HE染色顯示，術后3個月和6個月，修復區(qū)有典型

11、透明軟骨結構，但是細胞密度比正常軟骨組織高；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色顯示修復組織表達軟骨特異Ⅱ型膠原成分；甲苯胺藍染色顯示修復組織合成軟骨基質(zhì)GAG。而單純PGA/PLA對照組則在術后3、6個月吸收，缺損區(qū)塌陷，覆蓋有纖維組織。 4.自體ADSCs修復豬膝關節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：術后3、6個月分別取材顯示，實驗組關節(jié)軟骨缺損區(qū)有軟骨樣組織填充。HE染色顯示，術后3個月和6個月，修復區(qū)有典型透明軟骨結構，但是細胞密度比正常

12、軟骨組織高；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色顯示修復組織表達軟骨特異Ⅱ型膠原成分；甲苯胺藍染色顯示修復組織合成軟骨基質(zhì)GAG。而單純PGA/PLA對照組則在術后3、6個月吸收，缺損區(qū)塌陷，覆蓋有纖維組織。 5.同種異體ADSCs修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)及負重區(qū)軟骨缺損的實驗研究：術后3、6個月分別取材發(fā)現(xiàn)，實驗組異體ADSCs-PGA/PLA復合物未能修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)軟骨缺損；術后3個月取材，實驗組異體ADSCs-PGA/PLA復合物

13、也未能修復豬膝關節(jié)負重區(qū)軟骨缺損。而PGA/PLA單層材料對照組均未被修復。 結論： 1.豬ADSCs在體外培養(yǎng)擴增能力強，具有向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化的多向分化能力。 2.PGA/PLA具有良好的細胞相容性，成軟骨誘導的豬ADSCs能在其上較好的粘附和生長，并能表達軟骨基質(zhì)GAG。 3.自體ADSCs-PGA/PLA復合物能夠修復豬膝關節(jié)非負重區(qū)的軟骨缺損，而單純PGA/PLA材料則