骨碎補(bǔ)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:1.骨碎補(bǔ)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)。2.觀測(cè)兔軟骨細(xì)胞-FN/PLGA/TGF-β1生物支架復(fù)合體對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究。
  方法:1.進(jìn)行兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、FCM檢測(cè)及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定;2.最佳濃度骨碎補(bǔ)干預(yù)兔 BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,通過(guò) MTT法對(duì)細(xì)胞活性的檢測(cè)、免疫組化對(duì)Ⅱ型膠原的測(cè)定及甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)GAG的合成等方法觀察體外培養(yǎng)的兔BMSCs增殖分化的情況,

2、并以此得到軟骨細(xì)胞;3.將聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)生物支架切成4mm*4mm*4mm大小,消毒,將誘導(dǎo)好的第2代軟骨細(xì)胞以4×1010/L體外接種于PLGA生物支架上,體外培養(yǎng)7天,觀察細(xì)胞在支架內(nèi)的生長(zhǎng)情況、形態(tài)及吸附、分布情況;行HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色,觀察軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及Ⅱ型膠原含量,并利用圖像分析軟件對(duì)Ⅱ型膠原免疫組化染色面積進(jìn)行分析;4.將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處,分別在4周,8周,12周取樣

3、,觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物對(duì)軟骨缺損的修復(fù)情況。
  結(jié)果:1.①兔BMSCs成均勻分布的簇狀生長(zhǎng)、形態(tài)梭形。在傳代培養(yǎng)中形態(tài)特性無(wú)明顯變化、均質(zhì)性提高,高表達(dá)CD44,不表達(dá)CD34,可證明為非造血干細(xì)胞。②骨碎補(bǔ)可以誘導(dǎo)兔BMSCs向軟骨細(xì)胞分化,誘導(dǎo)后的細(xì)胞能分泌細(xì)胞外基質(zhì),例如Ⅱ型膠原蛋白,用組織學(xué)檢查及Ⅱ型膠原抗體免疫熒光檢測(cè)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。2.①HE染色對(duì)照組支架纖維組織有所增加,未見成軟骨細(xì)胞和軟骨

4、組織,支架被少許骨基質(zhì)及纖維組織填充;試驗(yàn)組支架降解成網(wǎng)狀并被吸收,成軟骨區(qū)圓形、橢圓形、多邊形成軟骨細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)逐漸增多,生成少量軟骨組織,并見少量多核的破骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì);空白組僅見少量淋巴細(xì)胞和纖維細(xì)胞,未見軟骨細(xì)胞。②Ⅱ型膠原染色細(xì)胞支架組軟骨區(qū)域PLGA生物支架逐漸降解減少,Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性逐漸增強(qiáng),類軟骨樣組織逐漸增多,術(shù)后12周后可見少許類軟骨樣組織;對(duì)照組和空白組術(shù)后Ⅱ型膠原染色均為陰性。③甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞支架組術(shù)后4

5、至8周甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性逐漸增強(qiáng),細(xì)胞核外類軟骨樣組織逐漸增多,術(shù)后12周有類軟骨樣組織生成;對(duì)照組和空白組各檢測(cè)周期甲苯胺藍(lán)染色陰性。3.電鏡掃描細(xì)胞支架組成軟骨區(qū)可見大量圓形、橢圓形軟骨細(xì)胞;對(duì)照組掃描電鏡下表面較粗糙,孔隙較多,大小不一,孔隙間多有交通,未發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞;空白組電鏡下未發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞生成。
  結(jié)論:1.通過(guò)體外對(duì)兔BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定,可建立較完善的BMSCs培養(yǎng)體系;骨碎補(bǔ)各組與陽(yáng)性對(duì)照組相比誘導(dǎo)作用弱,

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