自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原材料修復(fù)狗關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)一直是臨床工作的難點(diǎn)。目前臨床上常用治療措施包括：關(guān)節(jié)清理術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、骨軟骨移植、骨膜移植等。這些方法均有一定的臨床效果，但修復(fù)效果并不令人滿意，因此尚需要進(jìn)一步研究。本研究從臨床需要出發(fā)，根據(jù)組織工程的原理，通過體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)，以膠原海綿作為支架材料，體外三維復(fù)合培養(yǎng)，進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)后，將細(xì)胞-支架材料復(fù)合物植入狗髕股關(guān)節(jié)面全層軟骨缺損處，用

2、以修復(fù)軟骨缺損。從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等方面對植入前的細(xì)胞一支架復(fù)合體和植入后對關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)進(jìn)行觀察和評估，探討MSCs復(fù)合膠原材料進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)的可行性，及自體MSCs復(fù)合膠原材料對狗關(guān)節(jié)軟骨全層缺損修復(fù)的效果，為組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 方法：①家犬10只，分別抽取骨髓，體外培養(yǎng)MSCs，傳代至第三代，復(fù)合于膠原海綿支架材料，然后對MSCs進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)，對復(fù)合細(xì)胞的支架材料進(jìn)行HE染色和II型膠原免疫組

3、織化學(xué)染色；②于家犬髕股關(guān)節(jié)面股骨側(cè)造直徑5mm全層軟骨缺損模型，以經(jīng)軟骨誘導(dǎo)的MSCs-膠原材料復(fù)合體對缺損進(jìn)行修復(fù)，以同樣面積的未經(jīng)軟骨誘導(dǎo)的MSCs-膠原材料復(fù)合體組和單純膠原材料組對缺損進(jìn)行修復(fù)以作為實(shí)驗(yàn)對照。術(shù)后6周和8周分批取材，作如下檢測：(1)大體觀察；(2)HE染色組織學(xué)觀察；(3)甲苯胺藍(lán)染色用以了解本研究對缺損的修復(fù)效果。 結(jié)果：l、MSCs復(fù)合支架材料進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)后，HE染色可見細(xì)胞廣泛分布于支架材料孔隙

4、間，多數(shù)細(xì)胞呈多角形或者不規(guī)則形，少數(shù)呈短梭形。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見支架材料孔隙問的細(xì)胞胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒，細(xì)胞周圍出現(xiàn)黃染區(qū)。而未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色結(jié)果為陰性。 2、狗關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù) ①經(jīng)軟骨誘導(dǎo)的MSCs-膠原材料復(fù)合體組：術(shù)后6周大體觀察，缺損表面較為光滑，與周圍正常軟骨組織色澤接近，修復(fù)組織與周圍軟骨界限仍可識(shí)別，HE切片上可見呈上皮樣生長的細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞分泌的甲

5、苯胺藍(lán)異染軟骨基質(zhì)；術(shù)后8周大體觀察，缺損表面基本光滑，可見較明顯半透明白色組織覆蓋，修復(fù)組織與周圍軟骨部分連接，組織缺損基本已修復(fù)，HE染色可見修復(fù)組織增殖活躍，細(xì)胞呈邊緣不規(guī)則的小蜂窩狀結(jié)構(gòu)，周圍有軟骨陷窩形成。甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞分布較6周時(shí)更為均勻。 ②未經(jīng)軟骨誘導(dǎo)的MSCs-膠原材料復(fù)合體組：術(shù)后6周大體觀察，缺損表面較為光滑，修復(fù)組織與與周圍正常軟骨組織界限仍可鑒別，HE切片上可見少數(shù)呈上皮樣生長的細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色

6、可見甲苯胺藍(lán)異染軟骨基質(zhì);術(shù)后8周大體觀察，缺損表面基本光滑，可見較明顯半透明白色組織覆蓋，修復(fù)組織與周圍軟骨部分連接，組織缺損大部分已修復(fù)，HE染色可見修復(fù)組織增殖活躍，甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞分布較6周時(shí)更為均勻。③單純膠原材料組:術(shù)后6周大體觀察標(biāo)本缺損區(qū)明顯凹陷，與周圍正常軟骨組織之間界限清晰，HE染色可見缺損區(qū)由纖維組織充填，細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣，周圍未見有異染的基質(zhì)，損傷區(qū)域未見材料殘留，甲苯胺藍(lán)染色未見甲苯胺藍(lán)異染的軟骨基質(zhì)；術(shù)后

7、8周時(shí)標(biāo)本缺損處為白色不透明組織覆蓋，表面粗糙，仍可見明顯凹陷，修復(fù)組織與周圍軟骨部分連接，HE染色可見缺損區(qū)纖維組織較6周時(shí)增多，甲苯胺藍(lán)染色仍未見甲苯胺藍(lán)異染的軟骨基質(zhì)。 結(jié)論： 1、MSCs種植于膠原材料，經(jīng)定向軟骨誘導(dǎo)后，可向軟骨組織方向分化。 2、MSCs復(fù)合膠原材料定向軟骨誘導(dǎo)對狗關(guān)節(jié)軟骨全層缺損具有修復(fù)作用，關(guān)節(jié)軟骨缺損處有軟骨樣組織填充。 3、隨著組織工程化軟骨植入時(shí)間的延長，新生軟骨組織