骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-TCP生物陶瓷修復(fù)山羊骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 目前臨床上較為成熟的軟骨修復(fù)技術(shù)包括骨髓刺激和移植兩大類：前者如軟骨下鉆孔術(shù)和微骨折技術(shù)；后者有自體骨軟骨鑲嵌成型術(shù)（Mosaicplasty）和自體軟骨細(xì)胞移植（ACI）術(shù)。但上述技術(shù)本身均有其各自的局限性。 磷酸鈣生物陶瓷作為一種優(yōu)秀的骨組織工程支架材料已被廣泛接受，其中應(yīng)用最多的是羥基磷灰石（HA）和β-磷酸三鈣（β-TCP）。β-TCP具有良好生物相容性和降解性、骨傳導(dǎo)能力佳、機(jī)械強(qiáng)度適中、微結(jié)構(gòu)和體內(nèi)降

2、解速率可操控等優(yōu)點(diǎn)。磷酸鈣生物陶瓷在被用作骨支架材料的同時(shí)，也已被用于組織工程軟骨的構(gòu)建，已有學(xué)者使用β-TCP復(fù)合軟骨細(xì)胞或成軟骨誘導(dǎo)的干細(xì)胞成功地進(jìn)行了軟骨構(gòu)建。 本研究以山羊BMSCs作為種子細(xì)胞，β-TCP生物陶瓷作為組織工程骨及軟骨的構(gòu)建材料。首先進(jìn)行山羊BMSCs的成骨成軟骨方面的誘導(dǎo)，以鑒定其多向誘導(dǎo)分化的能力；進(jìn)而采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記山羊BMSCs，研究其對(duì)山羊BMSCs標(biāo)記的可行性及其最佳標(biāo)

3、記濃度和時(shí)間，以及對(duì)標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的增殖的影響，為確認(rèn)下一步山羊體內(nèi)實(shí)驗(yàn)形成的新生軟骨組織來源提供研究基礎(chǔ)；最后，利用負(fù)壓抽吸的方法，使山羊BMSCs結(jié)合于β-TCP生物陶瓷，設(shè)計(jì)并制作雙腔生物反應(yīng)器，在其中分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化和成軟骨誘導(dǎo)分化；并制作山羊膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，將在雙腔生物反應(yīng)器中分別誘導(dǎo)2周的β-TCP-細(xì)胞復(fù)合物移植于山羊膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損部位，觀察其對(duì)骨軟骨缺損的治療效果，為臨床利用自體BMSCs進(jìn)行組織工程修復(fù)骨軟骨缺損提

4、供尋找一種新的方法。 材料與方法: 1.山羊BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定及向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 抽取10月齡健康中國(guó)青山羊骨髓，全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs，體外培養(yǎng)至第4代（P4）時(shí)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定，并加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為：終濃度為100nmol/l地塞米松、10mmol/1β-磷酸甘油、50ug/ml抗壞血酸的10%FBS高糖DMEM；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：終濃度

5、為6.25μg/ml胰島素、6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、50ug/ml抗壞血酸、100nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1的10%FBS高糖DMEM。誘導(dǎo)兩周后分別行細(xì)胞化學(xué)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色，并采用逆轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)0、1、2、4周的I型膠原、Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達(dá)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果用x±s表示，p值<0.05為有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)差異。第4代和第8代的細(xì)胞倍增時(shí)間的比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各時(shí)間點(diǎn)mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量的比較，應(yīng)用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD法。 2、BrdU體外標(biāo)記山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究。 利用BrdU標(biāo)記山羊BMSCs，檢測(cè)其最佳標(biāo)記時(shí)間、標(biāo)記劑量及毒性作用，探討其作為山羊BMSCs標(biāo)記示蹤方法的可行性。培養(yǎng)山羊BMSCs，取第4代細(xì)胞以濃度分別為5、10、15

7、和20μmol/L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記，分別記為A、B、C、D組；另1孔不含BrdU，作為空白對(duì)照（E組）。分別標(biāo)記12、24、48和72h后，采用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞陽(yáng)性率，并用苔盼藍(lán)拒染法測(cè)定標(biāo)記后細(xì)胞活率。并觀察山羊BMSCs標(biāo)記后向骨和軟骨細(xì)胞的分化；使用MTT法檢測(cè)標(biāo)記后細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率和標(biāo)記前后存活率的均值比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析；細(xì)胞標(biāo)記前、后的細(xì)胞倍增時(shí)間的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P<0.05為

8、有顯著性差異。 3、雙腔攪拌式生物反應(yīng)器的制作及組織工程骨軟骨修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)缺損的體內(nèi)研究。 制作雙腔攪拌式生物反應(yīng)器。取第4代山羊BMSCs，以5×107/ml的細(xì)胞密度與β-TCP生物陶瓷相復(fù)合。在雙腔生物反應(yīng)器中誘導(dǎo)2周后，將BMSCs-β-TCP生物陶瓷復(fù)合物植入山羊膝關(guān)節(jié)缺損區(qū)域內(nèi)。于山羊的雙后肢股骨內(nèi)髁負(fù)重區(qū)制造直徑6mm和深度12mm的缺損，使用外徑為6mm的環(huán)鋸，在負(fù)重位置的軟骨上鉆孔，取出骨和軟骨碎屑后

9、，壓配方式植入直徑6mm，長(zhǎng)度12mm的BMSCs-β-TCP生物陶瓷復(fù)合物，缺損區(qū)域表面用復(fù)合山羊BMSCs的1.2%藻酸鈉與102mM氯化鈣交聯(lián)形成的凝膠覆蓋。根據(jù)植入物在生物反應(yīng)器中是否經(jīng)力學(xué)刺激，將山羊分為三組：A組：力學(xué)刺激+雙向誘導(dǎo)組；B組：?jiǎn)渭冸p向誘導(dǎo)組；C組：空白對(duì)照組。每組山羊各4只，共12只24個(gè)膝關(guān)節(jié)。術(shù)后圈養(yǎng)，不限活動(dòng)，于術(shù)后12周、24周分別處死各組2只山羊。進(jìn)行如下項(xiàng)目檢測(cè)：大體觀察；組織學(xué)及組織化學(xué)檢測(cè)：H

10、E染色；甲苯胺藍(lán)染色；Masson染色，Ⅱ型膠原免疫組化，并觀察Brdu的表達(dá)。進(jìn)行O'Driscoll，Keeley and Salter組織形態(tài)學(xué)評(píng)分。評(píng)分后的數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用兩因素方差分析，組間比較用LSD法，以P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)的山羊BMSCs形態(tài)呈紡錘狀或梭狀，折光性好，貼壁生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，集落中細(xì)胞形態(tài)為典型的梭形細(xì)胞，并逐漸融合成片。培養(yǎng)7～8

11、d約80%融合，9～10d可形成90%融合的細(xì)胞單層。傳代細(xì)胞大部分為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較原代細(xì)胞明顯增快，潛伏期為2～3d后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7～8d進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，可見表達(dá)BMSCs標(biāo)志物CD29，而不表達(dá)傳代造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，能分化出成熟的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；2周后分別行成骨細(xì)胞鑒定可見堿性磷酸酶染色、茜素紅染色呈陽(yáng)性，行成軟骨細(xì)胞鑒定

12、可見甲苯胺藍(lán)和阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性。RT-PCR、Western blot及免疫細(xì)胞染色結(jié)果均證實(shí)其向成骨和成軟骨細(xì)胞的分化。第4代和第8代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)增殖狀況無明顯差別（t=0.342，p=0.741），并且，在成骨及成軟骨誘導(dǎo)2周時(shí)，Collagen Ⅰ、Ⅱ和Aggrecan mRNA和蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)后4周無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），與未誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)1周組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。 2.第4代山羊BMSCs經(jīng)Brd

13、U標(biāo)記后行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下胞核呈綠色熒光。隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)和BrdU劑量的增加，標(biāo)記率逐漸增高，BrdU終濃度為15μmol/L且標(biāo)記48h后細(xì)胞標(biāo)記率>90%，但標(biāo)記時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)和BrdU濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞標(biāo)記率無明顯增高，表明BrdU標(biāo)記山羊BMSCs的最佳濃度為15 μmol/L，最佳標(biāo)記時(shí)間為48h。與正常未標(biāo)記細(xì)胞比較，標(biāo)記后細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)增殖狀況無明顯差別（t=0.178，p=0.862），活細(xì)胞數(shù)>98%。

14、15μmol/LBrdU標(biāo)記山羊BMSCs48h后不影響向成骨和成軟骨細(xì)胞分化的能力。 3.術(shù)后12周取材，A組修復(fù)區(qū)可見部分軟骨樣組織，關(guān)節(jié)軟骨無磨損，修復(fù)的軟骨呈白色半透明外觀，與周圍正常關(guān)節(jié)軟骨有連續(xù)性，可見一明顯的凹陷，無明顯軟骨下骨外露；B組修復(fù)區(qū)也可見部分軟骨樣組織，關(guān)節(jié)軟骨在修復(fù)區(qū)可見磨損，軟骨呈白色不透明外觀，軟骨下骨形成較好；空白對(duì)照組術(shù)區(qū)關(guān)節(jié)凹陷，無關(guān)節(jié)軟骨組織形成，關(guān)節(jié)下骨缺如。BrdU免疫熒光證實(shí)，新生軟

15、骨中部分細(xì)胞來源于植入的山羊自體BMSCs。組織學(xué)檢查示，β-TCP生物陶瓷已基本吸收降解。術(shù)后24周取材，見A組山羊手術(shù)區(qū)關(guān)節(jié)表面較為光滑，與周邊正常軟骨自然連續(xù)平齊，透明的新生軟骨組織形成，軟骨下骨形成完好；B組山羊手術(shù)區(qū)修復(fù)的軟骨組織基本完整，中心部位仍未完全融合，有微小凹陷；Ⅱ型膠原免疫組化示新生軟骨組織呈棕黃色。C組術(shù)區(qū)關(guān)節(jié)凹陷，無關(guān)節(jié)軟骨組織形成。A組和B組，軟骨下骨的生長(zhǎng)及與周圍組織的結(jié)合均較好，無植入物脫落現(xiàn)象的發(fā)生。

16、 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：A組在山羊體內(nèi)形成的軟骨質(zhì)量?jī)?yōu)于B組，O'Driscoll Keeley and Salter組織形態(tài)學(xué)評(píng)分為：A組12周（n=4）16.00±0.816，24周（n=4）18.75±0.957；B組（n=4）12周11.00±0.816，24周（n=4）14.75±0.957；C組未形成軟骨，12周及24周時(shí)各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論： 1、髂骨骨髓穿刺可分離出BMS

17、Cs。全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的BMSCs生長(zhǎng)至第4代時(shí)，純度較高，活力旺盛。本實(shí)驗(yàn)證明，山羊BMSCs具有向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的潛能，并且其在成骨和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周時(shí)，其可表達(dá)成骨和成軟骨的標(biāo)志。山羊BMSCs來源豐富、取材容易，創(chuàng)傷小，是理想的組織工程種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。 2、BrdU標(biāo)記山羊BMSCs的最佳時(shí)間為48小時(shí)；最佳終濃度為15μmol/L；標(biāo)記陽(yáng)性率>90%。BrdU對(duì)細(xì)胞無毒副作用，安全性高，