人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物陶瓷體外成骨能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立體外分離、培養(yǎng)和鑒定hMSCs的方法體系：探討貝奧路生物陶瓷復(fù)合hMSCs的生物相容性及誘導(dǎo)成骨能力，并評(píng)價(jià)其構(gòu)建組織工程骨的可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法： 1. 建立hMSCs體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法體系。 用Percoll梯度分離液離心分離單個(gè)核細(xì)胞后，置于37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增。倒置顯微鏡觀察；測(cè)定其生長增殖曲線；酶聯(lián)免疫法行細(xì)胞表面抗原檢測(cè)。取生長狀態(tài)良好的第三代hMS

2、Cs，用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)；倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞形態(tài)變化；行堿性磷酸酶染色和Von—Kossa法鈣結(jié)節(jié)染色。 2. hMSCs復(fù)合貝奧路生物陶瓷體外成骨能力的實(shí)驗(yàn)研究。 實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞和生物陶瓷復(fù)合體；對(duì)照組：以相同的細(xì)胞數(shù)接種到12孔培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在相同的條件下行成骨誘導(dǎo)。倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；MTT檢測(cè)其生長增殖情況；堿性磷酸酶染色及定量檢測(cè)測(cè)定其變化情況;Von—Kossa法鈣結(jié)節(jié)染色。行

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，假定P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1. 密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離提純hMSCs，體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞在48h內(nèi)有少量細(xì)胞貼壁，隨后形成紡錐狀成纖維細(xì)胞樣集落單位，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致；細(xì)胞生長增殖活躍；CD29和CD71表達(dá)陽性，CD34表達(dá)陰性。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3天堿性磷酸酶染色陽性，第7天Von—Kossa法鈣結(jié)節(jié)染色陽性。 2. hMSCs能夠貼附在貝奧路生物陶

4、瓷表面及孔隙內(nèi)生長；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的生長曲線形態(tài)一致，在誘導(dǎo)培養(yǎng)早期、中期的OD值無顯著性意義(P＞0.05)，而晚期(第9天和第10天)差異有顯著性意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在誘導(dǎo)的第3天堿性磷酸酶染色陽性，但兩組在各時(shí)間點(diǎn)堿性磷酸酶定量檢測(cè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；兩組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)行Von-Kossa法鈣結(jié)節(jié)染色均有顯著差別。 結(jié)論： 1. hMSCs取材安全、方便；密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法