骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合Col-Ⅰ支架人工骨的體外成骨分化研究.pdf

1、外傷、炎癥、腫瘤切除及先天畸形造成的骨缺損是一類常見(jiàn)而復(fù)雜的疾病，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。目前臨床仍以自體骨移植作為骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但因供體缺乏，供區(qū)損傷而使臨床應(yīng)用受限。學(xué)者們?cè)噲D尋找可以和自體骨的成骨性能相媲美的人工骨修復(fù)材料。理想的人工材料修復(fù)骨缺損過(guò)程是生物支架材料在體內(nèi)逐漸降解吸收的同時(shí)種子細(xì)胞不斷增殖分化，最終形成新的骨組織。傳統(tǒng)方法中收獲種子細(xì)胞時(shí)使用的胰蛋白酶會(huì)破壞種子細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞間連接蛋白，影響細(xì)胞活性。接

2、種到多孔支架材料中的一部分細(xì)胞會(huì)因未與支架材料貼附而流失。而新技術(shù)細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology, CST)[1]可收獲完整的細(xì)胞膜片，保留了細(xì)胞自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)以及一些重要的細(xì)胞表面蛋白如離子通道、生長(zhǎng)因子受體等，并且減少了細(xì)胞流失。目前細(xì)胞膜片技術(shù)已成功應(yīng)用于構(gòu)建心肌、角膜、食管上皮、牙周韌帶[2，3]等，但是在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用尚不明確。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)容易分離獲取，有良好的自

3、我更新及成骨分化潛力，是骨缺損修復(fù)的理想種子細(xì)胞。理想的支架材料應(yīng)具有生物相容性、可降解性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，植入骨缺損處后可逐漸降解，最終被新生成的骨組織取代。Col-Ⅰ是骨基質(zhì)的主要成分，其疏松多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的粘附植入，且具有成骨誘導(dǎo)作用，是理想的骨修復(fù)支架材料。
　　目的:
　　本研究通過(guò)細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片并復(fù)合Col-Ⅰ支架制成生物材料人工骨，并與散在細(xì)胞復(fù)合支架構(gòu)建的生物材

4、料人工骨進(jìn)行體外成骨分化能力的比較，探討細(xì)胞膜片技術(shù)在骨缺損修復(fù)中的優(yōu)勢(shì)。
　　方法:
　　制備納米級(jí)多孔Col-Ⅰ支架，通過(guò)高密度連續(xù)培養(yǎng)及機(jī)械吹落的方法獲得包含多層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞膜片，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片及散在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別結(jié)合Col-Ⅰ支架材料，培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液，于不同時(shí)間點(diǎn)比較兩者成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、骨橋蛋白(OPN)表達(dá)量以及鈣結(jié)節(jié)的形成量，綜合評(píng)價(jià)兩者的成骨分化能力

5、。
　　結(jié)果:
　　1.ALP活性:細(xì)胞結(jié)合支架后第3天和第7天，細(xì)胞膜片組(47.03±6.37 U/L，22.61±1.95 U/L)比散在細(xì)胞組(34.58±2.43 U/L，16.28±104 U/L)有更高的ALP活性(P＜0.05)。
　　2.OPN蛋白表達(dá):細(xì)胞結(jié)合支架后第7、14、21、28天，細(xì)胞膜片組(1113.1±27.5ng/ml,966.5±95.2 ng/ml,1173.2±111.6 ng

6、/ml,1157.6±47.4 ng/ml)比散在細(xì)胞組（943.5±18 ng/ml，735.8±101.7 ng/ml，1133.6±89.8 ng/ml，1077.2±137.6ng/ml）有更大的OPN蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。
　　3.鈣結(jié)節(jié)形成量:細(xì)胞結(jié)合支架后第28天，掃描電鏡可見(jiàn)細(xì)胞膜片組鈣結(jié)節(jié)形成的密度明顯高于散在細(xì)胞組。X射線能譜分析結(jié)果顯示礦化結(jié)節(jié)主要由鈣、磷、碳、氧四種元素構(gòu)成，細(xì)胞膜片組鈣元素含量(0.