間充質(zhì)干細胞復合多孔支架修復骨與軟骨缺損的實驗性研究.pdf

1、軟骨缺損在運動損傷中非常常見，臨床中表現(xiàn)為膝關節(jié)疼痛，處理不當可能導致關節(jié)絞索、關節(jié)畸形等，最終導致骨關節(jié)炎的發(fā)生，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。關節(jié)軟骨本身血供較差，成熟的軟骨細胞發(fā)生損傷后依靠自體的修復能力有限。目前臨床上采用關節(jié)軟骨鉆孔、微骨折等多種治療方法嘗試修復缺損的軟骨，但長期臨床效果難以讓人滿意。當軟骨損傷累及軟骨下骨時，治療更為困難。由于開放性損傷、慢性骨髓炎和骨腫瘤切除引起的骨缺損是目前臨床實踐中的另一項難題。治療骨缺損的金

2、標準取自體骨植骨術(shù)，但取自體骨存在供區(qū)損傷和供區(qū)骨量有限的局限。異體骨移植存在免疫排斥骨愈合緩慢等問題。
　　近些年來，組織工程技術(shù)為骨和軟骨缺損的治療提供了新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細胞因具有良好的多向誘導分化潛能是目前研究最多的種子細胞。近些年脂肪來源間充質(zhì)干細胞具有來源豐富、擴增能力強，同時可以多向誘導分化逐漸成為組織工程領域研究熱點。三維支架在組織工程中起著支持引導干細胞增殖并提供三維構(gòu)建模板的作用。近些年來合成材料應用逐步增

3、多，PLGA是目前FDA批準的可以用于人體組織工程的支架材料，具有降解速度可調(diào)節(jié)和良好的機械性能，但是組織相容性差，很多研究學者嘗試對PLGA支架進行修飾改善其組織相容性取得了一定的成效。明膠海綿是另一種目前臨床中廣泛應用的商業(yè)化產(chǎn)品，因其多孔狀結(jié)構(gòu)、良好的組織相容性以及可降解性同時也是一種良好的組織工程支架。
　　在軟骨修復中軟骨下骨占據(jù)重要地位，本研究擬采用羥基磷灰石(HA)改善PLGA組織相容性，同時羥基磷灰石具有骨誘導和骨

4、傳導有利于軟骨下骨的再生。
　　骨發(fā)生的方式分為膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨，長骨自然發(fā)生的方式和骨折保守治療的愈合方式均為軟骨內(nèi)成骨。研究表明軟骨內(nèi)成骨可以加速骨愈合，有利于再生骨的血管化。本研究擬采用明膠海綿作為多孔支架，采用體外誘導ADSC軟骨分化進行體內(nèi)修復大鼠軟骨缺損，進一步明確軟骨內(nèi)成骨在大鼠骨缺損愈合中的作用。
　　本研究主要分為三部分:(1) PLGA/NHA支架的構(gòu)建以及MSC在支架上的增殖分布;(2) PLGA/

5、NHA多孔支架修復大鼠關節(jié)軟骨缺損的實驗研究;(3)明膠海綿多孔支架復合成軟骨誘導ADSC經(jīng)軟骨內(nèi)成骨修復大鼠節(jié)段性骨缺損的實驗研究。
　　第一部分 PLGA/NHA支架的構(gòu)建以及MSC在支架上的增殖分布
　　目的:構(gòu)建PLGA/NHA支架，并研究MSC在支架上的增殖和分布情況。
　　方法:采用熱誘導相分離技術(shù)制備PLGA/NHA多孔支架，并采用掃描電鏡、力學測試等研究材料的特征。取第三代MSCs，通過MTT、DNA定

6、量實驗了解細胞在支架上的增殖情況;通過掃描電鏡和CM-DiI熒光染色了解MSC在支架上的粘附分布情況。
　　結(jié)果:本研究中的PLGA/NHA支架呈多孔狀，平均孔隙率為88.3％±2.8％。生物力學測試結(jié)果顯示PLGA/NHA支架的彈性模量要大于PLGA支架。MTT和DNA定量結(jié)果顯示MSC在PLGA/NHA多孔支架上的增殖數(shù)量顯著高于PLGA多孔支架。掃描電鏡顯示MSCs在PLGA/NHA支架孔壁上鋪展良好并分泌大量基質(zhì)，激光共聚

7、焦顯微鏡顯示MSCs在PLGA/NHA支架上比PLGA多孔支架上細胞數(shù)目更多分布更密集。
　　結(jié)論:添加納米HA顆粒可以改善MSC在PLGA支架上的生長、粘附和PLGA支架的機械性能，通過NHA修飾的PLGA可以作為組織工程支架用于修復骨軟骨缺損。
　　第2章 PLGA/NHA多孔支架修復大鼠關節(jié)軟骨缺損的實驗研究
　　目的:觀察PLGA/NHA多孔支架復合骨髓間充質(zhì)干細胞修復大鼠關節(jié)骨軟骨缺損以及移植MSC最終分化命

8、運。
　　方法:分離MSC并用CM-DiI進行標記，將MSC接種到PLGA/NHA和PLGA支架上，植入大鼠股骨遠端直徑1.5mm全層骨與軟骨缺損處，分別在術(shù)后6周和12周處死，進行大體觀察、HE染色、番紅染色以及免疫組化染色等進行評價骨軟骨修復情況。
　　結(jié)果:研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后12周PLGA/NHA-MSCs組軟骨缺損處再生的軟骨為光滑透明軟骨，富含GAG和Ⅱ型膠原，但是不合Ⅰ型膠原。我們通過CM-DiI追蹤MSCs研究發(fā)

9、現(xiàn)，CM-DiI標記的細胞在術(shù)后12周仍位于修復區(qū)域。
　　結(jié)論:PLGA/NHA復合MSC可以有效的修復關節(jié)骨軟骨缺損，改善軟骨修復質(zhì)量，移植的MSC可以在骨軟骨修復早期大量存活，改善局部再生微環(huán)境，而不需要再添加生長因子。PLGA/NHA復合MSC可以作為一種修復骨軟骨缺損的有效組織工程材料，可以進一步在臨床上應用。
　　第3章明膠海綿多孔支架復合成軟骨誘導ADSC經(jīng)軟骨內(nèi)成骨修復大鼠節(jié)段性骨缺損的實驗研究
　　目

10、的:研究明膠海綿多孔支架復合經(jīng)成軟骨誘導的ADSC經(jīng)軟骨內(nèi)成骨修復大鼠節(jié)段性骨缺損的效果。
　　方法:取大鼠腹股溝脂肪按照貼壁法分離ADSCs，將分離的ADSC進行成骨、成脂和成軟骨分化誘導進行鑒定。將明膠海綿支架切成方形，掃描電鏡觀察明膠海綿結(jié)構(gòu)。將ADSCs接種到明膠海綿支架上，并進行DNA定量檢測評價ADSC在支架上的增值情況。創(chuàng)建大鼠脛骨骨缺損（2mm）模型。將接種在明膠海綿支架上的ADSC進行成軟骨誘導（ADSC-CD）

11、14天，大鼠脛骨缺損處分別采用空白、明膠海綿、明膠海綿-ADSC、明膠海綿-ADSC-CD組進行填充。分別在術(shù)后2周、4周和8周取材大鼠脛骨進行X線、microCT影像學評估，進行病理染色評價成骨以及成軟骨情況。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)我們分離的ADSC可以進行多向分化，ADSC在明膠海綿多孔支架上增殖良好。動物研究發(fā)現(xiàn)大鼠骨缺損術(shù)后2周明膠海綿-ADSC-CD組已經(jīng)出現(xiàn)富合GAG的基質(zhì)和軟骨細胞，這表明已經(jīng)啟動軟骨內(nèi)成骨，而空白組和

12、明膠海綿組未見明顯GAG基質(zhì)和軟骨細胞出現(xiàn)。術(shù)后8周X線和miroCT發(fā)現(xiàn)明膠海綿-ADSC-CD組脛骨完全愈合，番紅O染色表明軟骨內(nèi)骨化已經(jīng)完成;而明膠海綿-ADSC組脛骨CT仍可見部分骨折線，番紅O染色表明仍有部分GAG在鈣化改建;空白組和明膠海綿組則骨折線仍清晰可見，番紅O染色表明骨折端仍富含GAG軟骨基質(zhì)，表明骨折仍處于軟骨內(nèi)成骨過程中。
　　結(jié)論:明膠海綿復合成軟骨誘導的ADSC可以加速軟骨內(nèi)成骨，加速骨折愈合，提高骨修