同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細胞復合β-磷酸三鈣支架修復兔橈骨大段骨缺損的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及多向誘導分化研究
　　目的:建立體外分離培養(yǎng)獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rabbit adipose-derivedmesenchymal stem cells，rADSCs)的方法，并對其形態(tài)學、生物學特性進行觀察并對其表面標志物進行鑒定;將分離培養(yǎng)的rADSCs體外誘導，使其向成骨、成脂方向分化，觀察其多向細胞分化的潛能。

2、　　方法:切取兔頸背區(qū)皮下脂肪，用0.1％I型膠原酶消化法獲得兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞，進行體外培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化法傳代擴增。用CCK-8法細胞增殖實驗繪制細胞增殖曲線。應用流式細胞術檢測細胞表面標志物。第4代rADSCs經(jīng)成脂誘導后，用油紅O染色，成骨誘導后，分別用茜素紅染色、堿性磷酸酶染色，觀察其成骨、成脂分化潛能。
　　結(jié)果:rADSCs細胞呈長梭形漩渦樣貼壁生長，增殖能力強。將第4代rADSCs用分子流式細胞儀檢測，可見C

3、D29、CD90、CD44陽性率高，而CD34和CD45陽性率低。第4代rADSCs在誘導劑的誘導下分化為脂肪細胞和成骨細胞，成脂誘導后的rADSCs經(jīng)油紅O染色呈陽性結(jié)果，成骨誘導后的rADSCs經(jīng)堿性磷酸酶和茜素紅染色均呈陽性結(jié)果。
　　結(jié)論:來源于兔頸背區(qū)的皮下脂肪組織取材相對容易且可供取材的組織量大，脂肪組織內(nèi)細胞量充足，可簡單進行體外分離培養(yǎng);兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rADSCs)在體外增殖速度快，能夠保持穩(wěn)定的傳代，直

4、至第10代;ADSCs具有分化成骨細胞、成脂細胞等多向細胞分化的潛能，是組織工程骨理想的種子細胞。
　　第二部分 兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞在β-磷酸三鈣支架上體外共培養(yǎng)，構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復合體及體外成骨分化的研究
　　目的:將β-磷酸三鈣（β-Tricalcium phosphate，β-TCP）支架與經(jīng)傳代分離獲取的兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞在體外共培養(yǎng)，構(gòu)建成rADSCs/β-TCP骨組織工程復合體，觀察

5、在組織工程支架上rADSCs向成骨細胞分化的能力。
　　方法:將體外分離培養(yǎng)的rADSCs接種于β-TCP支架上，從在β-TCP支架上加入細胞懸液開始計時，在細胞培養(yǎng)的第24h開始，每24h至第7d進行CCK-8檢測細胞在材料中的增殖情況，培養(yǎng)7d后用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒檢測細胞在材料內(nèi)表達ALP的情況，以rADSCs直接接種于12孔板培養(yǎng)貼壁生長作為對照組，在相同時間點進行細胞

6、增殖以及ALP活性的檢測，結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。將rADSCs細胞懸液接種于β-TCP支架上，在體外共培養(yǎng)3d和7d，在掃描電鏡下觀察其生長情況。
　　結(jié)果:經(jīng)CCK-8法檢測，細胞在支架材料上增殖的結(jié)果示:各組的吸光度都隨時間延長而逐漸升高，與β-TCP支架共培養(yǎng)7d的細胞與對照組相比較，第2天、第5天細胞與支架材料共培養(yǎng)組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義，在支架材料上的細胞增殖能力較強，其余時間點的兩組間差異均無統(tǒng)計學意義;并且隨著時

7、間的延長，細胞的增殖不受影響并具有良好的生物學活性。ALP活性測定結(jié)果表明，接種的rADSCs細胞在β-TCP支架上生長良好，具有較高的ALP活性，與對照相比，差異有統(tǒng)計學意義，β-TCP具有一定的促進細胞成骨作用。掃描電鏡觀察細胞與材料接觸緊密，細胞呈長梭形伸展，分布均勻。
　　結(jié)論:β-TCP支架具有良好的生物相容性，rADSCs在支架上共培養(yǎng)時支架材料不具有細胞毒性;rADSCs在β-TCP支架上共培養(yǎng)后，細胞的增殖能力無明

8、顯減弱，并且仍具有向成骨分化的能力。
　　第三部分 應用rADSCs/β-TCP骨組織工程復合體修復兔橈骨大段骨缺損的實驗研究
　　目的:以β-TCP陶瓷為支架材料，復合兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞，探討構(gòu)建組織工程骨修復骨缺損的可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)的兔脂肪源性間充質(zhì)干細胞(rADSCs)接種于β-TCP支架上，構(gòu)建rADSCs/β-TCP骨組織工程復合體，并進行體外培養(yǎng)。制備兔橈骨2cm長度的節(jié)段性骨缺損模型，分三

9、組進行骨缺損治療的研究:空白對照組（A組）不植入任何材料，單β-TCP人工骨對照組（B組），rADSCs/β-TCP復合體實驗組（C組）。各組8只兔16例骨缺損。在手術后2周，4周，6周和8周時進行X線檢查，按Lane-Sandhu X線評分法對骨愈合情況進行比較，X線檢查后每組各選2只兔處死后取出標本，對標本進行大體觀察以及進行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察骨修復情況，并觀察是否發(fā)生免疫排斥反應。
　　結(jié)果:通過Lane-Sandhu

10、 X線評分進行統(tǒng)計學分析，C組比B組在各時間點評分均略高，但其差異無統(tǒng)計學意義，其兩組的評分均明顯高于A組，手術后8周結(jié)果示A組與其它兩組間差異均有統(tǒng)計學意義。組織學觀察C組在術后4周可觀察到骨缺損周圍開始形成新生骨，并隨著時間的延長新生骨量逐漸增多，在術后6周時，材料逐漸降解，材料孔隙內(nèi)有新生骨長入，在術后8周時，材料降解明顯，材料孔隙基本消失，髓腔已基本再通。而至術后8周，2例B組及4例A組骨缺損未愈合，髓腔不通，與實驗組有明顯差異