自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和同種異體軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1 探討自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem.cells，BMSCs)和同種異體軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的可行性，為擴(kuò)大和優(yōu)化軟骨組織工程種子細(xì)胞源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2 共培養(yǎng)細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular derma matrix，ADM)復(fù)合修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供理論依據(jù)和奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、 方法：選用健康的4-6月齡新西蘭兔36只，2-4周齡幼兔12只。使用酶消化分離法獲得軟骨細(xì)胞，使用密度梯度離心和貼壁篩選的方法獲得BMSCs。取細(xì)胞濃度為3×105/ml的第二代BMSCs和軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為三組，A組：將BMSCs和軟骨細(xì)胞按2:1比例混勻，作為共培養(yǎng)組(最終濃度為3×105/ml)，B組為濃度為3×105/ml的單獨(dú)軟骨細(xì)胞組，C組為低濃度單純軟骨細(xì)胞組(濃度為1×105/ml，與A組中軟骨細(xì)胞濃度相同)，將三組進(jìn)

3、行比較，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并測(cè)定消化液中糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)含量。用小牛真皮制備ADM作為細(xì)胞載體，將A組共培養(yǎng)細(xì)胞與ADM體外復(fù)合培養(yǎng)3天后，移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損處。將36只新西蘭兔隨機(jī)分為共培養(yǎng)細(xì)胞/ADM實(shí)驗(yàn)組、ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組髁間窩軟骨缺損處植入共培養(yǎng)細(xì)胞/ADM，ADM對(duì)照組單純植入膠原膜，空白對(duì)照組不作任何植入，分別于術(shù)后4周、8周和12周每組各處死4只動(dòng)物，取材對(duì)修復(fù)組

4、織進(jìn)行大體、組織學(xué)及免疫組化染色觀察，根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨大體及組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行評(píng)分，數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0軟件，用隨機(jī)分組的SNK-q法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組的評(píng)分差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：A組細(xì)胞平均群體倍增時(shí)間為3天，B組為7天，C組為8天，A組共培養(yǎng)細(xì)胞增殖比B組和C組明顯增快，有顯著性差異(p<0.05)；三組細(xì)胞中GAG含量A組明顯多于B、C兩組，有顯著性差異(p<0.05)。術(shù)后12周共培養(yǎng)細(xì)胞/AD

5、M實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織呈透明軟骨樣，表面光滑平坦，與周圍軟骨及軟骨下骨整合良好，而ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組為纖維性修復(fù)和無(wú)修復(fù)。修復(fù)組織大體評(píng)分共培養(yǎng)細(xì)胞/ADM實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，ADM對(duì)照組優(yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)；組織學(xué)評(píng)分顯示共培養(yǎng)細(xì)胞/ADM實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，ADM對(duì)照組和空白組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。免疫組化染色顯示共培養(yǎng)細(xì)胞/ADM實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)

6、的軟骨細(xì)胞呈柱狀排列，富含Ⅱ型膠原，與周圍軟骨及軟骨下骨結(jié)合良好。 結(jié)論：自體BMSCs與同種異體軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞共培養(yǎng)，BMSCs能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，縮短軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和減少傳代次數(shù)，同時(shí)軟骨細(xì)胞可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)化，可節(jié)省大量的軟骨細(xì)胞： 自體BMSCs與同種異體軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)未見(jiàn)明顯排異反應(yīng)；ADM適合共培養(yǎng)細(xì)胞的黏附和增殖，是軟骨組織工程理想的支架材料；ADM接種共培養(yǎng)細(xì)胞植